Rasvan ja luuytimen mesenkymaalisten kantasolujen transfektiotekniikoiden testaus
Partanen, Ida (2018)
2018
Bioteknologian tutkinto-ohjelma - Degree Programme in Biotechnology
Lääketieteen ja biotieteiden tiedekunta - Faculty of Medicine and Life Sciences
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2018-06-26
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:uta-201806282119
https://urn.fi/URN:NBN:fi:uta-201806282119
Tiivistelmä
Tiivistelmä
Tausta ja tavoitteet: Mesenkymaalisia kantasoluja käytetään kudosteknologian lääketieteellisiin sovelluksiin. Aikuisen mesenkymaalisista kantasoluista eniten tutkittuja ovat luuytimen kantasolut, mutta viime aikoina rasvan kantasolujen käyttö on yleistynyt niiden helpomman saatavuuden vuoksi. Työn tarkoituksena oli testata ja optimoida eri transfektiotekniikoita rasvan ja luuytimen kantasoluilla. Transfektioon käytettiin Actin Chromobody -TagGFP plasmidia ja pmaxGFP plasmidia. Actin Chromobody-plasmidin sisältämän VHH sekvenssin tuottama proteiini sitoutuu solujen aktiinitukirankaan, jolloin proteiinin fluoresoiva osa värjää koko tukirangan vihreäksi. pmaxGFP-plasmidin tuottama proteiini puolestaan sitoutuu epäspesifisesti soluelimiin ja värjää ne myös vihreiksi fluoresoivan proteiinin avulla.
Menetelmät: Työssä on käytetty neljää transfektio-menetelmää cDNA-plasmidin siirtoon mesenkymaalisiin kantasoluihin: FuGENE HD reagenssia, Lipofectamine3000 transfektioreagenssia, kalsiumfosfaattisaostusta ja elektroporaatiota. Menetelmien onnistumista seurattiin fluoresenssimikroskoopilla ja analysoimalla kvalitatiivisesti vihreällä fluoresoivien solujen määrää kasvustossa. Lisäksi työssä oli mukana siRNA-transfektion testaus, jossa kohteeksi valittiin CIP2A-proteiini. siRNA-transfektion onnistumista tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla sekä analysoimalla proteiinin tasoja Western blot- menetelmällä. Rasvan ja luuytimen kantasoluja kasvatettiin niille tyypillisessä peruskasvatusmediumissa. Päivää ennen transfektion suorittamista mesenkymaaliset kantasolut maljattiin 24-kuoppalevylle. Transfektio suoritettiin seuraavana päivänä ja mikroskooppianalyysit sekä Western blot-analyysi 48 tunnin päästä transfektiosta.
Tulokset: Transfektio-menetelmien onnistuminen vaihteli eri solunäytteiden välillä huomattavasti. Kaikilla menetelmillä saatiin transfektoitua soluja, mutta paras tehokkuus saavutettiin sähkövirtaan perustuvalla elektroporaatiolla. Sekä rasvan että luuytimen kantasoluilla siRNA transfektion tehokkuus havaittiin erittäin hyväksi, sillä CIP2A-proteiinin tasot putosivat siRNA käsittelyn jälkeen n. 93-100 prosentilla verrattuna scrambled siRNA vertailunäytteisiin.
Johtopäätökset: Menetelmien avulla saatiin transfektoitua sekä rasvan että luuytimen kantasolutyyppejä vaihtelevalla menestyksellä. Transfektion onnistumiseen vaikutti sekä menetelmä että solutyyppi. Molemmilla testatuilla kantasolutyypeillä elektroporaatio ja Lipofectamine3000 reagenssi toimivat parhaiten. Kalsiumfosfaattisaostus ja FuGENE HD menetelmät vaativat vielä optimointia, jotta niiden avulla transfektio onnistuisi tehokkaammin.
Abstract
Background and aims: Mesenchymal stem cells are used for medical applications in tissue engineering. Bone marrow stem cells are the most studied adult stem cells, but recently adipose derived stem cells have become more common because of their easier availability. The aim of this study was to test and optimize different transfection techniques for adipose and bone marrow stem cells. Actin Chromobody-GFP plasmid and pmaxGFP plasmid were used for transfection. The protein produced by the VHH sequence of Actin Chromobody plasmid binds to the actin cytoskeleton and the fluorescent part of the protein stains it green. The protein produced by pmaxGFP plasmid binds unspesifically to cell organs and also stains them green with a fluorescent protein.
Methods: Four transfection methods were used for cDNA plasmid transfer into mesenchymal stem cells in this study: FuGENE HD reagent, Lipofectamine3000 transfection reagent, calcium phosphate and electroporation. The success of the methods was examined under a fluorescence microscope and by analyzing qualitatively the amount of green fluorescent cells in the culture. In addition, one siRNA transfection method was also tested, with CIP2A protein as the target. The success of siRNA transfection was examined by fluorescent microscopy and by analyzing the protein levels with Western blot method. The adipose and bone marrow stem cells were cultured in a medium typical for them. One day before transfection the mesenchymal stem cells were plated on a 24-well plate. Transfection was performed the following day and the microscopy analysis and Western Blot analysis were performed 48 hours after transfection.
Results: The success of transfection methods varied considerably between different cell samples. All methods were capable of transfecting cells, but the best efficiency was achieved with electroporation based on electric current. In adipose and bone marrow stem cells the efficacy of siRNA transfection was found to be very good because the levels of CIP2A protein were reduced after the siRNA treatment for about 93 to 100 percent compared to the scrambled siRNA reference samples.
Conclusions: The methods have provided transfection of both stem cells types with varying success. Both method and cell type affected the transfection success. For both tested stem cells types electroporation and Lipofectamine3000 reagent worked best. Calcium phosphate and FuGENE HD methods require further optimization, so that transfection would be more efficient.
Tausta ja tavoitteet: Mesenkymaalisia kantasoluja käytetään kudosteknologian lääketieteellisiin sovelluksiin. Aikuisen mesenkymaalisista kantasoluista eniten tutkittuja ovat luuytimen kantasolut, mutta viime aikoina rasvan kantasolujen käyttö on yleistynyt niiden helpomman saatavuuden vuoksi. Työn tarkoituksena oli testata ja optimoida eri transfektiotekniikoita rasvan ja luuytimen kantasoluilla. Transfektioon käytettiin Actin Chromobody -TagGFP plasmidia ja pmaxGFP plasmidia. Actin Chromobody-plasmidin sisältämän VHH sekvenssin tuottama proteiini sitoutuu solujen aktiinitukirankaan, jolloin proteiinin fluoresoiva osa värjää koko tukirangan vihreäksi. pmaxGFP-plasmidin tuottama proteiini puolestaan sitoutuu epäspesifisesti soluelimiin ja värjää ne myös vihreiksi fluoresoivan proteiinin avulla.
Menetelmät: Työssä on käytetty neljää transfektio-menetelmää cDNA-plasmidin siirtoon mesenkymaalisiin kantasoluihin: FuGENE HD reagenssia, Lipofectamine3000 transfektioreagenssia, kalsiumfosfaattisaostusta ja elektroporaatiota. Menetelmien onnistumista seurattiin fluoresenssimikroskoopilla ja analysoimalla kvalitatiivisesti vihreällä fluoresoivien solujen määrää kasvustossa. Lisäksi työssä oli mukana siRNA-transfektion testaus, jossa kohteeksi valittiin CIP2A-proteiini. siRNA-transfektion onnistumista tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla sekä analysoimalla proteiinin tasoja Western blot- menetelmällä. Rasvan ja luuytimen kantasoluja kasvatettiin niille tyypillisessä peruskasvatusmediumissa. Päivää ennen transfektion suorittamista mesenkymaaliset kantasolut maljattiin 24-kuoppalevylle. Transfektio suoritettiin seuraavana päivänä ja mikroskooppianalyysit sekä Western blot-analyysi 48 tunnin päästä transfektiosta.
Tulokset: Transfektio-menetelmien onnistuminen vaihteli eri solunäytteiden välillä huomattavasti. Kaikilla menetelmillä saatiin transfektoitua soluja, mutta paras tehokkuus saavutettiin sähkövirtaan perustuvalla elektroporaatiolla. Sekä rasvan että luuytimen kantasoluilla siRNA transfektion tehokkuus havaittiin erittäin hyväksi, sillä CIP2A-proteiinin tasot putosivat siRNA käsittelyn jälkeen n. 93-100 prosentilla verrattuna scrambled siRNA vertailunäytteisiin.
Johtopäätökset: Menetelmien avulla saatiin transfektoitua sekä rasvan että luuytimen kantasolutyyppejä vaihtelevalla menestyksellä. Transfektion onnistumiseen vaikutti sekä menetelmä että solutyyppi. Molemmilla testatuilla kantasolutyypeillä elektroporaatio ja Lipofectamine3000 reagenssi toimivat parhaiten. Kalsiumfosfaattisaostus ja FuGENE HD menetelmät vaativat vielä optimointia, jotta niiden avulla transfektio onnistuisi tehokkaammin.
Abstract
Background and aims: Mesenchymal stem cells are used for medical applications in tissue engineering. Bone marrow stem cells are the most studied adult stem cells, but recently adipose derived stem cells have become more common because of their easier availability. The aim of this study was to test and optimize different transfection techniques for adipose and bone marrow stem cells. Actin Chromobody-GFP plasmid and pmaxGFP plasmid were used for transfection. The protein produced by the VHH sequence of Actin Chromobody plasmid binds to the actin cytoskeleton and the fluorescent part of the protein stains it green. The protein produced by pmaxGFP plasmid binds unspesifically to cell organs and also stains them green with a fluorescent protein.
Methods: Four transfection methods were used for cDNA plasmid transfer into mesenchymal stem cells in this study: FuGENE HD reagent, Lipofectamine3000 transfection reagent, calcium phosphate and electroporation. The success of the methods was examined under a fluorescence microscope and by analyzing qualitatively the amount of green fluorescent cells in the culture. In addition, one siRNA transfection method was also tested, with CIP2A protein as the target. The success of siRNA transfection was examined by fluorescent microscopy and by analyzing the protein levels with Western blot method. The adipose and bone marrow stem cells were cultured in a medium typical for them. One day before transfection the mesenchymal stem cells were plated on a 24-well plate. Transfection was performed the following day and the microscopy analysis and Western Blot analysis were performed 48 hours after transfection.
Results: The success of transfection methods varied considerably between different cell samples. All methods were capable of transfecting cells, but the best efficiency was achieved with electroporation based on electric current. In adipose and bone marrow stem cells the efficacy of siRNA transfection was found to be very good because the levels of CIP2A protein were reduced after the siRNA treatment for about 93 to 100 percent compared to the scrambled siRNA reference samples.
Conclusions: The methods have provided transfection of both stem cells types with varying success. Both method and cell type affected the transfection success. For both tested stem cells types electroporation and Lipofectamine3000 reagent worked best. Calcium phosphate and FuGENE HD methods require further optimization, so that transfection would be more efficient.