Neuronal differentiation, maturation and adhesion in vitro in 3D - effect of cell source and hydrogel scaffold

Abstract

There is a great need for novel tissue engineering (TE) applications for central nervous system (CNS) defects, like spinal cord injury (SCI). One promising approach for neural TE is to combine human stem cell-derived neural cells with a three-dimensional (3D) scaffold. The aim of this study was to find an optimal cell source and a basement hydrogel for 3D in vitro studies of neural cells. In addition, association between adhesion and maturation of the neural cells was examined.

In this study, both human embryonic stem cell (hESC) and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) -derived neural cells as well as commercial line of human neural precursor cells (hNPC) was used. These three cell types were cultured in six different hydrogels, shown before to be cytocompatible scaffolds for neural cells: Puramatrix, Gellan gum, HA1-PVA1, HALD-PVA, HA-Col1-4SPEG and Collagen I. Cells were cultured both on top of the gels as 2D culture and encapsulated inside the gels as 3D culture to study more reliably differences between 2D and 3D environments. Also, more conventional 2D controls, laminin and Matrigel, were included. Differentiation, maturation and adhesion of the neural cells in above mentioned environments were studied with immunocytochemical labeling.

There was a remarkable variance between the cell types cultured in different environments. As a conclusion, according to results of this study, neurons derived from hNP1 cell line had the lowest amount of neurite spreading overall, whereas neurons derived from Regea 08/023 cell line favored 2D conditions over 3D. Thus, the 10212.EURCCs would be the best cell source for future 3D studies. For all cell types, the best hydrogel regarding to neurite spreading was Collagen I. It was also found, that studied adhesion markers of neural cells were more expressed on top of hydrogels than encapsulated in and their expression were more prominent after two than four weeks of culturing on 2D.

Novel criteria for evaluation of gel properties was created, and was combined with neurite spreading analysis to have a wider view for determination of the best hydrogel. All the studied hydrogels supported neuronal differentiation, but as a sign of maturation, neuronal network formation was clearly best in Collagen I hydrogel, while the gel properties were best with Gellan gum and worst with HA-Col1-4SPEG. As a conclusion, Collagen I based hydrogel scaffold, supported with mechanically more stable one, would be the best option for future studies of 3D neuronal models.

TIIVISTELMÄ Keskushermoston vakavien sairauksien ja traumojen hoitomuodot ovat puutteellisia ja keskittyvät lähinnä toimintakyvyn parantamiseen erilaisin kuntoutuskeinoin. Tulevaisuudessa ihmisen kantasoluista erilaistetuista hermosoluista ja sopivasta biomateriaalista rakennettu siirre voi olla potentiaalinen keskushermostovamman hoitomuoto. Tämän tutkielman tavoitteina oli löytää sopiva solulähde sekä hydrogeeli pohjaksi tuleviin tutkimuksiin nimenomaan kolmiulotteisessa (3D) solukasvatusympäristössä. Myös kantasoluista hermosoluiksi erilaistettujen solujen ympäristöönsä kiinnittymisen ja kypsymisen yhteyttä haluttiin tutkia.

Tässä työssä verrattiin ihmisalkion kantasoluista ja ihmisen indusoiduista pluripotenteista kantasoluista erilaistettujen sekä kaupallisten ihmisen esihermosolujen ominaisuuksia kuudessa eri hydrogeeli-materiaalissa. Nämä olivat Puramatrix, Gellan gum, HA1-PVA1, HALD-PVA, HA-Col1-4SPEG ja Collagen I, joiden kaikkien on osoitettu olevan hermosoluille potentiaalisia kasvuympäristöjä. Soluja kasvatettiin sekä hydrogeelien päällä että sisällä, minkä lisäksi kontrolleina toimivat perinteisemmät kaksiulotteiset (2D) solukasvatuspinnoitteet laminiini ja Matrigeeli. Näissä olosuhteissa tutkittiin hermosolujen erilaistumisen, kypsymisen ja kiinnittymisen eroja kaksiulotteisen ja kolmiulotteisen ympäristön välillä sekä eri materiaaleissa vasta-ainetunnistukseen perustuvalla värjäysmenetelmällä.

Solutyyppien välillä oli huomattavia eroja eri materiaaleissa. Kokonaisuudessaan paras valinta jatkotutkimuksiin hydrogeeleissä olisi 10212.EURCC-solulinjasta erilaistetut solut, sillä Regea 08/023 –linjasta erilaistetut solut suosivat enemmän 2D-kasvatusta ja hNP1-solulinjan hermosoluilla oli vähiten neuriittien levittymistä, mikä on edellytys hermoverkostojen kasvulle. Kaikista solutyypeistä erilaistetut hermosolut levittivät selvästi eniten neuriittejaan Collageeni I-geelissä. Tämän lisäksi saatiin selville, että hermosolujen kiinnittymiseen liittyvät proteiinit ilmentyivät enemmän 2D- kuin 3D-viljelyssä, samoin kuin niiden ilmentyminen oli voimakkaampaa kahden kuin neljän viikon kasvatuksen jälkeen 2D-pinnoilla.

Hydrogeelien ominaisuuksia arvioitiin myös itse kehitetyllä kriteeristöllä, jonka avulla geelien mahdollisuuksia käyttöön tulevaisuuden sovelluksissa voidaan vertailla. Tämä kriteeristö yhdistettynä neuriittien levittymiseen antoi laajemman kuvan parhaasta materiaalivalinnasta tuleviin tutkimuksiin, ja tämän kuvan perusteella jatkotutkimuksia tulisikin tehdä Collageeni I-pohjaisella geelillä, joka kuitenkin tulisi yhdistää johonkin mekaanisilta ominaisuuksiltaan parempaan ja kestävämpään geeliin.