Nuclear import protein KPNA7 and its cargos : Diverse roles in the regulation of cancer cell growth, mitosis and nuclear morphology

Abstract

Aitotumalliset eli eukaryoottiset solut sisältävät useita eri soluelimiä eli organelleja, kuten tuman. Tumakalvo erottaa tuman solulimasta eli sytoplasmasta ja muodostaa esteen makromolekyylien, kuten proteiinien, kulkeutumiselle tuman ja sytoplasman välillä. Solunsisäisen tasapainon ylläpitämiseksi solut tarvitsevat kuljetusmekanismin, jonka avulla suuret makromolekyylit kuljetetaan aktiivisesti osastosta toiseen. Tumakuljetuksen häiriöt voivat johtaa moniin eri sairauksiin, esimerkiksi syöpään. Karyoferiini alfa -proteiiniperheen jäsenet ovat tumakuljetusproteiineja, jotka huolehtivat makromolekyylien kuljetuksesta sytoplasmasta tumaan. Karyoferiini alfa 7 (KPNA7) on kyseisen proteiiniperheen uusin jäsen. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli kartoittaa KPNA7:n ilmentymistasoja syöpäsoluissa ja aikuisen terveissä kudoksissa sekä selvittää KPNA7:n merkitystä syöpäsolujen kasvulle, pahanlaatuisille piirteille, tumanjakautumiselle ja tumamorfologian ylläpidolle. Lisäksi pyrittiin tunnistamaan KPNA7:n tumaan kuljettamia proteiineja.

Geeniekspressiotutkimukset osoittivat, että KPNA7:n ilmentyminen on uudelleenaktivoitu syöpäsoluissa. Korkeimmat ilmentymistasot havaittiin haimasyöpäsolulinjoissa, joissa esiintyy KPNA7:n sisältävän geenialueen 7q21-22 monistuma. Terveissä aikuisen kudoksissa geeniä ei ilmennetä. KPNA7:n merkitystä syöpäsolujen toiminnalle tutkittiin hiljentämällä KPNA7-geeni syöpäsolupaneelissa ja tarkastelemalla hiljentämisen aiheuttamia muutoksia kyseisten solujen toiminnassa. KPNA7-hiljennys vähensi dramaattisesti solujen kasvua aiheuttaen solusyklin S-vaiheessa olevien solujen määrän vähenemisen. Lisäksi solujen kyky kasvaa pintaan kiinnittymättä väheni ja niissä havaittiin autofagian indusoituminen. Immunofluoresenssimenetelmien avulla havaittiin myös, että KPNA7:n väheneminen häiritsi solujen tumarakennetta ja tumanjakautumista eli mitoosia, aiheuttaen lohkomaisen tuman muodon ja moninapaisen tumasukkulan Hs700T-haimasyöpä- ja T-47D-rintasyöpäsoluissa.

Edellä saadut tulokset johtivat hypoteesiin, että KPNA7:n hiljentäminen johtaa sen kuljettamien ns. lastiproteiinien väärään sijoittumiseen solussa ja sitä kautta havaittuihin ilmiasuihin eli fenotyyppeihin. Proteiinien pull-down ja massaspektrometria -menetelmien avulla tunnistettiin yhteensä 377 proteiinia, jotka edustavat todennäköisiä KPNA7:n lastiproteiineja. Suurin osa näistä proteiineista tiedettiin tai ennustettiin sijoittuvan tumaan. In vitro -sitoutuminen KPNA7:n kanssa varmistettiin kahden proteiinin osalta. Nämä proteiinit olivat major vault protein (MVP) ja zinc finger protein 414 (ZNF414). Lisäksi osoitettiin, että KPNA7:n hiljennys todellakin estää näiden proteiinien tumakuljetuksen. MVP:llä ja ZNF414:llä huomattiin olevan kasvunsäätelyrooli haimasyöpäsoluissa, mikä viittaa siihen, että ne voivat hyvinkin olla vastuussa KPNA7:n hiljennyksen seurauksena havaitusta syöpäsolujen kasvun vähenemisestä.

Tutkimuksen tulokset osoittavat, että KPNA7 osallistuu syöpäsolujen kasvun ja elinkyvyn säätelyyn. Todennäköisesti säätely tapahtuu KPNA7:n tumaan kuljettamien proteiinien, kuten MVP:n ja ZNF414:n kautta. Tulokset myös tarjoavat uutta tietoa KPNA7:n osuudesta asianmukaisen mitoosin ja tumakalvon rakenteen säätelyssä, ja syventävät tietämystämme tumakuljetusproteiinien merkityksestä syövän synnyssä.

Eukaryotic cells are compartmentalized to contain diverse organelles such as the nucleus. The separation of the nucleus from the cytoplasm by the nuclear envelope forms a barrier across which large macromolecules, such as proteins, need to be transported to maintain cellular homeostasis. Disturbances in nuclear import can lead to various diseases, including cancer. Karyopherin alpha 7 (KPNA7) is the newest member of the karyopherin alpha protein family of nuclear importers responsible for the nucleocytoplasmic transport of macromolecules. The aim of this study was to evaluate KPNA7 expression levels in cancer cells and healthy adult tissues, to characterize the effect of KPNA7 expression on cancer cell growth, malignant properties, mitosis and nuclear morphology and to identify KPNA7 cargo proteins.

Gene expression studies revealed that KPNA7 expression is reactivated in cancer cell lines, with highest expression detected in pancreatic cancer cell lines harboring an amplification of the 7q21-22 genomic locus where KPNA7 is located. In contrast, KPNA7 expression is almost absent in healthy adult tissues. To probe the consequences of the expression, KPNA7 was silenced in the cell lines with endogenous expression of the gene. The silencing of KPNA7 led to decreased proliferation via reduced number of cells in the S-phase of the cell cycle, reduced migration and anchorage-independent growth, and induction of autophagy. By utilizing immunofluorescent assays, it was also noted that KPNA7-silencing leads to lobulated nuclei and disturbed mitosis via multipolar mitotic spindles in Hs700T pancreatic and T-47D breast cancer cell lines.

These data led to the hypothesis that the altered subcellular localization of KPNA7 cargo proteins is responsible for the cellular phenotypes observed after KPNA7 silencing. By utilizing protein pull-down and mass spectrometry, we identified 377 KPNA7 cargo protein candidates, most of which were known or predicted to localize to the nucleus. Two proteins, namely major vault protein (MVP) and zinc finger protein 414 (ZNF414), were shown to bind KPNA7 in vitro and their transport to the nucleus was hindered by KPNA7 silencing. These proteins were also shown to have growth regulatory roles in pancreatic cancer cells.

Together these results suggest that KPNA7, probably via its cargo proteins including MVP and ZNF414, participates in the regulation of phenotypes that are essential for growth and viability of cancer cells. The results also shed light on the contribution of KPNA7 to the regulation of proper mitosis and maintenance of nuclear envelope environment and deepen our understanding on the role of nuclear transfer proteins in cancer pathogenesis.