Zebrafish Model for Studying the Disease Spectrum of Tuberculosis

Abstract

Tuberkuloosi on yksi maailman tappavimmista infektioista: vuosittain 1,8 miljoonaa ihmistä kuolee Mycobacterium tuberculosis -bakteerin aiheuttamaan tautiin. Tuberkuloosibakteerin aiheuttama tautikirjo on laaja, ja bakteerille altistuminen voi johtaa akuuttiin infektioon tai latenttiin eli oireettomaan tautiin, joka saattaa aiheuttaa vakavan taudin jopa vuosikymmenien hiljaiselon jälkeen. Mykobakteerien pitkälle kehittyneet virulenssimekanismit estävät ja muovaavat isäntäeliön puolustusjärjestelmän toimintaa, mikä mahdollistaa mykobakteerien selviytymisen elimistössä. Nykyisen tuberkuloosirokotteen heikon tehon ja turvallisuusongelmien vuoksi rokote on poistettu suomalaisesta rokoteohjelmasta, ja lisääntyvä antibioottiresistenssi hankaloittaa taudin hoitoa yhä enenevissä määrin. Uusien, tehokkaampien rokotteiden ja hoitomuotojen kehittämiseen tarvitaan yksityiskohtaista tietoa taudilta suojaavien immuunivasteiden luonteesta.

Suuri osa mykobakteeri-infektioiden patogeneesin yksityiskohdista on selvitetty soluviljelymalleja käyttäen. Koska bakteerin ja eri tyyppisten isäntäsolujen yhteispeli vaikuttaa infektion kulkuun monimutkaisella tavalla, laajempien tutkimuskysymysten selvittelyyn tarvitaan eläinmalleja. Tätä väitöstutkimusta varten olen kehittänyt metodiikkaa, joka hyödyntää aikuisen seeprakalan (Danio rerio) ja Mycobacterium marinum -infektion uudenlaisena ihmisen tuberkuloosimallina. M. marinum on luontainen kalapatogeeni, joka on läheistä sukua M. tuberculosis -bakteerille. M. marinumia on käytetty menestyksekkäästi seeprakalan poikasmallissa mykobakteerien ja synnynnäisen immuniteetin solujen välisen vuorovaikutuksen tutkimiseen. Koska hankinnaisen immuniteetin tiedetään vaikuttavan keskeisesti tuberkuloosin patogeneesiin, tässä väitöstutkimuksessa käytettiin aikuisia kaloja, joilla nämäkin mekanismit ovat pitkälle kehittyneet.

Tässä väitöskirjatutkimuksessa havaittiin, että suuren M. marinum -annoksen (n. 2000 bakteeria) injektointi aiheutti vakavan taudin suurelle osalle kaloista ensimmäisten viikkojen aikana. Pienen annoksen infektio (<100 bakteeria) sen sijaan aiheutti ihmisen luonnolliselle tuberkuloosi-infektiolle tyypillisen laajan tautikirjon, jossa n. 10 % kykeni välttämään infektion, n. 10 % sai aktiivisen primääri-infektion, n. 65 % kehitti latentin infektion ja n.15 % itsekseen uudelleen aktivoituneen taudin latentin vaiheen jälkeen. Matalan annoksen infektio oli suurimmalla osalla kaloista oireeton koko 8 kuukauden seurantajakson ajan. Latenttia infektiota kantavista kaloista pystyttiin todentamaan uinuvia mykobakteereja sekä qPCR:n että tässä tutkimuksessa kehitetyn maljausmenetelmän avulla. Latentin infektion aktivaatio voitiin aiheuttaa kokeellisesti poistamalla lymfosyyttejä gammasäteilytysmenetelmällä.

Lymfosyyttien poistamisen aiheuttama latentin taudin aktivaatio oli yksi osoitus näiden solujen tärkeydestä kalan M. marinum -infektiossa. Hankinnaisen immuniteetin tärkeys varmistui kokeissa, joissa matalan annoksen M. marinum -infektio aiheutti lymfosyyttipuutteisille rag1 (-/-) -kaloille vakavan taudin. Verrattuna villityypin kaloihin, rag1-mutanttien infektiossa bakteerimäärät kasvoivat korkeammiksi, uinuvia bakteereja oli vähemmän ja kalojen kuolleisuus oli korkeampi.

Tarkoituksiimme sopiviksi kehittämieni qPCR:ään perustuvien menetelmien avulla oli mahdollista mitata mykobakteerien määrää, kalan immuunivastetta ja mykobakteerin uinumista samasta yksilöstä ja etsiä yhteyksiä immuunivasteen ja mykobakteerien kasvun välillä. Itsestään uudelleen aktivoituneeseen infektioon liittyi T-solujen kokonaismäärän kasvu. Erityisesti säätelevään auttaja-T-soluvasteeseen liittyvän foxp3:n tuotto lisääntyi. Säätelevien T-soluvasteiden merkitys ihmisen latentin tuberkuloosin aktivaatiolle on mielenkiintoinen tulevaisuuden tutkimusaihe. Oireettomassa populaatiossa korkea T-solujen kokonaismäärä oli yhteydessä isännän kykyyn rajoittaa mykobakteerien kasvua. Korkea mykobakteerimäärä oli yhteydessä matalaan tyypin 2 auttaja-T-soluvasteeseen (Th2). Th2-vaste oli matala myös uudelleenaktivoituneessa taudissa. Ihmisen tuberkuloosidiagnostiikassa ja rokotteiden kehityksessä on tähän asti korostettu Th1-vasteita. Olisi syytä tutkia, voisiko Th2-vasteita mitata ihmisen verinäytteistä latentin taudin aktivoitumisriskin arvioimiseksi. Th2-vasteiden mahdollista hyödyllisyyttä tuberkuloosirokotteissa olisi myös hyvä arvioida uudelleen.

Seeprakalamallissa testattiin myös immuunivastetta muokkaavia aineita, joita injektoitiin kaloihin ennen infektointia. Tarkoituksena oli löytää käsittely, joka aktivoisi immuunivastetta tuhoamaan mykobakteereja tehokkaammin. Lämpötapetun Listeria monocytogenes -bakteerin injektointi päivää ennen matalan annoksen M. marinum -infektiota laski mykobakteerien määrää sekä lisäsi infektoitumiselta suojautuneiden kalojen osuutta. Käsittely suojasi myös lymfosyyttipuutteisia rag1 (-/-) -kaloja. Käsittely aiheutti tuumorinnekroositekijä alfaa (Tnfα) sekä typpioksidisyntaasi 2b:ä (Nos2b) koodaavien geenien ilmentymisen lisääntymistä ja superoksididismutaasi 2:a (Sod2) koodaavan geenin ilmentymisen vähenemistä, mikä viittaa solunsisäisten tappomekanismien tehostumiseen. Löydökset ovat tärkeitä uudentyyppisten, isännän immuunivasteita ohjailevien hoitomuotojen kehittämisen kannalta.

Aikuisen seeprakalan M. marinum infektio on yksinkertainen ja käyttökelpoinen malli, jossa voidaan tutkia tuberkuloosin tautikirjoa. Seeprakalassa kehittyy latentti infektio, jossa nähdään myös uinuvia mykobakteereja. Se on lupaava in vivo -malli, jossa voitaisiin tutkia aivan uudenlaisia, latenssia ja uudelleenaktivaatiota estäviä rokotteita sekä etsiä uinuviin bakteereihin tehoavia hoitomuotoja. Tässä työssä kehitetyllä herkällä qPCR-menetelmällä voidaan havaita sekä aktiiviset että uinuvat mykobakteerit seeprakalan kaikista kudoksista. Seeprakalan M. marinum -infektio on näin ollen verraton työkalu tuberkuloosi-infektion sterilointiin tähtäävien hoitomuotojen kehittämiseen.

Tuberculosis (TB) remains one of the deadliest infections worldwide killing 1.8 million people every year. Infection with Mycobacterium tuberculosis can lead to a spectrum of different outcomes including primary active and latent infection, the latter of which usually remains asymptomatic but has the potential to cause a severe, reactivated infection after decades of quiescence. The successful pathogenic strategies of M. tuberculosis allow the bacteria to circumvent and direct host immune responses to promote their own survival. The lack of an efficient and safe vaccine and the decreasing efficacy of antibiotic treatments against TB substantiate the urgent need for more powerful weaponry to control this devastating disease. Knowledge of the nature of protective immune responses furthers the development of prevention and treatment strategies against TB.

A myriad of studies elucidating the details of mycobacterial pathogenesis has been carried out in in vitro models. However, the outcome of an infection is a product of the complex interplay between the bacteria and a multitude of host cells necessitating the use of in vivo models. In this thesis, I have developed new methodology to utilize the adult zebrafish (Danio rerio) and its natural pathogen Mycobacterium marinum to model the pathogenesis of human tuberculosis. M. marinum is a close relative of M. tuberculosis and has been successfully used in zebrafish larvae to elucidate the interactions between the bacterium and innate immune cells. As the adaptive arm of immunity is known to centrally affect the pathogenesis of human TB, the adult zebrafish with a fully developed adaptive immune system was exploited in this study to establish an even more comprehensive model of mycobacterial disease.

In this study, injecting a large dose (~2000 bacteria) of M. marinum caused a progressive infection with high mortality. In contrast, injection of a small dose (<100 bacteria) created a vast disease spectrum closely resembling that seen in human TB with bacterial clearance (~10 %), primary active (~10 %), stable latent (~65 %) and reactivated infection (~15 %). The majority of the low-dose-infected fish remained asymptomatic during the 8-month follow-up, although the presence of mycobacteria could generally be verified by qPCR. Dormant bacteria were detected in the latently infected individuals with qPCR as well as by a novel plating method. The latent infection could be experimentally reactivated by depletion of lymphocytes by gammairradiation.

The efficacy of lymphocyte depletion in causing reactivation of infection demonstrated the central role of these cells in controlling M. marinum infection in the fish. The importance of adaptive immunity was further verified by showing that rag1 (-/-) mutants lacking functional lymphocytes had higher mortality and developed higher mycobacterial loads with less dormant bacteria.

With the qPCR methodology developed for this study, it was possible to measure mycobacterial loads, host immune responses and mycobacterial dormancy from each individual to find associations between the host immune response and the control of mycobacterial growth. Spontaneous reactivation of M. marinum infection was accompanied by an increase in total T cell number. Foxp3 expression was specifically increased compared to latent infection reflecting an increase in regulatory T helper responses in a reactivated infection. The role of regulatory T cell responses in the context of the reactivation of human tuberculosis should be assessed in future investigations. Among the individuals with an asymptomatic infection, high T cell numbers were found to be associated with limited mycobacterial growth. In the individuals with the most progressed mycobacterial infection, T helper 2 (Th2) responses were specifically lacking. The low Th2 response was also seen in spontaneously reactivated infection. So far, TB diagnostics and vaccination strategies have heavily relied on the measurement and induction of Th1 responses. The biomarker potential of Th2 responses to estimate the risk of reactivation should be studied in human blood samples. Moreover, based on these results, the possible protective effects Th2 responses in the context of vaccine induced immunity against tuberculosis should be reassessed.

The adult zebrafish-M. marinum model was also used to test immunoactivators to study, whether the host immune response could be directed to more efficiently kill mycobacteria. Injection with heat-killed Listeria monocytogenes 1 day prior to low-dose infection with M. marinum led to significantly lower mycobacterial loads. Importantly, the proportion of individuals able to clear the infection was significantly increased by priming. The bacterial clearance occurred also in the absence of adaptive immunity as shown by using rag1 (-/-) fish. The protective effect was accompanied by the up-regulation of the genes encoding tumor necrosis factor α (Tnfα), nitric oxide synthase 2b (Nos2b) and the down-regulation of the gene encoding superoxide dismutase 2 (Sod2), suggesting that intracellular killing mechanisms were more activated in the primed group. These findings pave the way for the development of host-directed therapies based on the direct induction of optimal innate immune responses against pathogenic mycobacteria.

The adult zebrafish-M. marinum system is a convenient non-mammalian model of the entire spectrum of mycobacterial disease, including spontaneous latency with dormant mycobacteria. It could serve as an in vivo platform to screen experimental vaccination strategies against latent and reactivated infection or treatments targeted at dormant mycobacteria. Due to the small size of the zebrafish and the sensitive qPCR-based method developed for detecting both actively dividing and dormant mycobacteria, bacterial clearance can be assessed in the zebrafish more reliably than any other animal. Thus, the zebrafish is an indispensable model in the quest for sterilizing treatments against tuberculosis.