Towards Modeling the Human Brain : Human Pluripotent Stem Cell Derived 3D Neural Cultures

Abstract

Johdanto: Kudosteknologia on monitieteellinen tutkimusala, jonka pitkän linjan tavoitteena on tuottaa uusia hoitomuotoja sairauksien hoitoon. Kudosteknologiassa yhdistetään biologiaa insinööritieteisiin ja pyritään laboratorio-oloissa luomaan keinotekoisia kudoksenomaisia viljelmiä, joissa soluja kasvatetaan biomateriaali-tukirakenteessa. Tämä väitöskirja keskittyy ihmisen keskushermoston kudosteknologisiin sovelluksiin. Keskushermosto, kuten muutkin kudokset, koostuu solujen lisäksi soluväliaineesta. Keskushermoston soluväliaine on erittäin pehmeä, mutta elastinen rakenne, joka koostuu nanokokoisista säikeistä. Biomateriaalit, joita käytetään viljelmän tukena voivat jäljitellä kohdekudoksen ominaisuuksia tai toimia mekaanisena tukena solujen kasvulle. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli luoda 3D-ympäristö, jota voidaan käyttää solumallin pohjana.

Materiaalit ja menetelmät: Tässä väitöskirjatyössä käytettiin ihmisen erittäin monikykyisistä kantasoluista erilaistettuja hermosoluja. 3D-soluviljelyn tukirakenteina käytettiin joko synteettistä PuraMatrix®-hydrogeeliä tai gellan gum -polysakkaridipohjaista hydrogeeliä. Solujen vastetta hydrogeeleihin tutkittiin kolmella erilaisella tutkimusasetelmalla: 1) viljelemällä soluja hydrogeelin alla, jolloin hydrogeeli geeliytettiin suoraan soluviljelmän päälle, 2) viljelemällä soluja esigeeliytetyn hydrogeelipinnan päällä tai 3) viljelemällä soluja sekoitettuna hydrogeeliin. Hydrogeelien lisäksi kolmiulotteisia hermoverkkoja kasvatettiin käyttämällä tukimateriaalina sylinterimäisiä polymeerikomposiitti mikrorakenteita – mikrotorneja. Solujen kasvua tarkasteltiin fluoresoivien leimojen avulla. Tässä väitöskirjatyössä on käytetty sekä yleisiä kaikkiin soluihin sitoutuvia leimoja että vasta-ainetunnistuksen avulla vain kohdeproteiiniinsa sitoutuvia leimoja. Lisäksi hermosoluviljelmien sähköistä aktiivisuutta tutkittiin mikroelektrodihilaan (microelectrode array, MEA) perustuvalla menetelmällä.

Tulokset: Eläviin soluihin sitoutuvat fluoresoivat merkkiaineet osoittautuivat hyväksi tutkimusmenetelmäksi. Menetelmän avulla nähtiin, että kahdesta eri viljelmästä peräisin olevat hermosolut pystyivät muodostamaan yhtenäisen hermoverkon, kun ne yhdistettiin samaan viljelmään. Tämän löydöksen soveltaminen jatkossa voi auttaa tutkimuksissa, joissa pyritään selvittämään solusiirrehoidoissa tarvittavaa hermoverkkojen yhteensulautumista. PuraMatrix®¬-hydrogeelin sisällä viljellyt hermosolut kypsyivät muodoltaan monimuotoisiksi sekä niiden sähköinen signalointi oli hermosoluille tyypillistä. Löydösten valossa PuraMatrix® materiaalina vaikuttaa soveltuvan hyvin hermosolujen viljelyalustaksi. Hermosoluille parhaimmat geelipitoisuudet muodostivat hyvin löyhän geelin, minkä johdosta näytteiden valmistus ja käsittely oli haastavaa. Tämä seikka huonontaa PuraMatrix®-hydrogeelin käytettävyyttä hermokudosmallin tukimateriaalina, vaikka muutoin tulokset ovat erittäin lupaavia. Gellan gum -pohjaisia geelejä apuna käyttäen tutkittiin tukimateriaalin jäykkyyden vaikutusta hermosolujen kasvuun ja yritettiin kartoittaa soluviljelyssä käytettävälle tukimateriaalin ihanteellisia ominaisuuksia. Jäykkyydeltään aivoja vastaava materiaali ei kuitenkaan osoittautunut solukokeissa parhaimmaksi. Tämän perusteella todettiin, että jäykkyyden lisäksi monet muut materiaalin ominaisuudet vaikuttavat solujen kasvuun. Parhaat tulokset saatiin gellan gum -hydrogeelillä, johon oli sekoitettu soluväliaineen proteiinia, laminiinia, lisäämään materiaalin bioaktiivisuutta. Hydrogeelien lisäksi sylinterimäiset polymeerikomposiittimikrotornit osoittautuivat erinomaisiksi alustoiksi pienten kolmiulotteisten hermoverkkojen viljelemiseen. Hermoverkkojen muodostuminen mikrotornien ympärille tapahtui toistettavasti ja hermoverkot noudattelivat mikrotornin rakennetta. Tämä työ tukee ajatusta, jonka mukaan kovista materiaaleista valmistettu tukirakenne on hyvä vaihtoehto laboratoriomallin pohjaksi.

Johtopäätökset: Väitöskirjatyön pohjalta voidaan todeta, että ihmisen hermosoluille ihanteellisen tukimateriaalin mekaanisten tai kemiallisten ominaisuuksien kartoittaminen ei ole yksioikoista. Monet tutkimukset keskittyvät tuottamaan monikäyttöisiä materiaaleja keskushermoston sovelluksiin. Tämä on haastavaa, sillä erilaisiin koeasetelmiin tarvitaan hyvin erilaisia ominaisuuksia. Tämän työn pohjalta herääkin kysymys siitä, olisiko parempi keskittyä materiaalin yleisen optimoinnin sijasta optimoimaan sen käyttöä soluviljelyalustana valikoiduissa sovelluksissa. Tämä tarkoittaisi materiaalin valitsemista tutkimuskysymyksen mukaan niin, että materiaalin ominaisuudet tukevat parhaalla mahdollisella tavalla tutkimuksen kohteena olevan ilmiön havaitsemista.

Background: This thesis focuses on in vitro tissue engineering (TE) applications for the central nervous system (CNS). TE is a multidisciplinary research field that aims at healing human tissues by developing novel engineered biological constructs. Typically, these constructs are composed of cells in a 3D biomaterial scaffold. One promising research platform for neural TE is the use of human stem cell derived neural cells, combined with a 3D scaffold, as a simplified model system for CNS – an in vitro neural model. The commonly used scaffold materials are brain extracellular matrix (ECM)-mimicking hydrogels or rigid microscale 3D matrices that support cell growth.

The main aim of this work was to create a 3D neural culturing setup that could serve as a brain tissue model in the future.

Materials and Methods: In this thesis, human pluripotent stem cell-derived neural cells were used. The neural cell cultures were visualized with fluorescent labeling, either using cell-accumulating probes or immunocytochemical labeling. Electrical neuronal network functionality was measured using a microelectrode array (MEA) platform. The hydrogels utilized were PuraMatrix®, a synthetic self-assembling hydrogel, and a natural polysaccharide gellan gum hydrogel crosslinked with spermidine (SPD). In this thesis, hydrogels were studied using three culturing methods: 1) Direct gelation of the hydrogel on top of the pre-cultured cell monolayer (2D); 2) Cells cultured on top of the hydrogel surface (2D); 3) Encapsulated cells cultured within the hydrogel (3D). Rigid tubular microtower scaffolds were polymerized using 2 photon-direct laser writing (2PP-DLW) from a polymer-ceramic hybrid material, Ormocomp.

Results: Fluorescent probes were found to be suitable for tracking human neural cells for up to four weeks in culture. Co-cultures from two pre-labeled neural populations formed a homogenous neural network in 2D culture, and the electrical neuronal network activity of these co-cultures was similar to that of the control cultures. Both of the studied hydrogel materials were optimized for human neural cell culturing by testing different hydrogel compositions. Interestingly, sparse hydrogels with low PuraMatrix® dilutions were best for neuronal cells, whereas stiff composition of gellan gum hydrogel supported neural networks better than the softer compositions. Neural networks cultured within the PuraMatrix® hydrogel were also shown to have spontaneous electrical activity. Maturation of neuronal activity was slow in the 3D setup; however, on the other hand, morphological inspection showed in vivo mimicking complexity in the cell morphology. Rigid microtower scaffolds were found to be effective for supporting 3D neural network formation around the scaffold. These neural networks were stable for up to four weeks in culture, even though a slight decrease in cell number was seen at the four-week time point.

Conclusions: Both of the studied scaffold types, hydrogels and rigid scaffolds, were suitable as a supporting matrix for the formation of 3D neural networks. Large neural networks randomly formed inside hydrogels and were anisotropic, whereas the networks formed around microtowers were smaller, but more easily controlled with the microtower design. All of the studied scaffold materials have potential in in vitro neural applications, but they are applicable to different study questions.