Development of MP-SPR biosensor analysis methology

Abstract

Optical biosensors have gained high regard in the field of drug industry and clinical diagnostics owing to the high specificity of biological recognition elements as well as to the non-invasiveness of optical detection methods. The flexible and efficient use of optical biosensors, however, requires that the user understands their basic physical, chemical, and biological principles as well as the advantages and limitations of these devices. The literature review introduces the fundamentals of biosensing and biosensors, and describes the principles, advantages and challenges related to one type of surface plasmon resonance (SPR) device.

In the experimental part of the thesis, a multiparametric SPR (MP-SPR)-system was used to measure the optical properties of samples in addition to the traditional adsorption of molecules. The concentrations and purity of protein solutions were determined by a UV-Vis spectrophotometer.

The first experimental part showed the reproducibility and repeatability of a regenerable IgG-sensing surface prepared using switchavidin (a neutralized avidin mutant) and protein G molecules. Furthermore, the sensing surface has ultralow fouling ability against some common model proteins. The immobilization of IgG-molecules did not show, however, reliable results. Additionally, the thesis represents a mechanical model for the switchavidin adsorption that is based on the MP-SPR measurement data. Further research could concentrate on the measurement of more complex samples as well as on the development of automation that is based on the represented mechanical adsorption model.

The second experimental part studied the applicability of a four-channel MP-SPR prototype into the measurement of fast association kinetics of small molecular weight (MW) drugs. A human carbonic anhydrase II enzyme was immobilized into a three-dimensional hydrogel matrix and the interaction kinetics of three sulfonamide inhibitors were compared with kinetic values in the literature. Only a single inhibitor (acetazolamide) gave satisfying results. In conclusion, the MP-SPR-prototype is capable of measuring the fast association kinetics of small MW drugs, but this requires the very accurate preparation of samples and buffers as well as the proper calibration of bulk responses.

TIIVISTELMÄ MP-SPR biosensorimittausten analyysimenetelmien kehittäminen

Optiset biosensorit ovat saaneet arvostusta lukuisissa käyttökohteissa, kuten lääketeollisuudessa ja kliinisessä diagnostiikassa, biologisen tunnistuselementin korkean spesifisyyden ja optisen detektiomenetelmän non-invasiivisuuden ansiosta. Optisen biosensorien tehokas ja joustava käyttö kuitenkin edellyttää, että käyttäjä ymmärtää näiden toiminnan fysikaalisia, kemiallisia ja biologisia perusperiaatteita sekä optisten menetelmien etuja ja rajoituksia. Tutkielman kirjallinen osa tutustuttaa biosensoreiden ja biosensoroinnin perusteisiin sekä esittelee erään optiseen pintaplasmoniresonanssiin (surface plasmon resonance, SPR) perustuvan laitteiston toimintaa, etuja ja haasteita.

Tutkielman kokeellisissa osuuksissa käytettiin multiparametrista SPR-laitteistoa (MP-SPR), joka kykenee mittaamaan molekyylien adsorption lisäksi laajasti näytteen optisia ominaisuuksia. Proteiiniliuoksien konsentraatiot sekä niiden puhtausasteet määritettiin UV-Vis-spektrofotometrilla.

Tutkielman ensimmäinen kokeellinen osuus osoitti switchavidiiniin (neutralisoitu avidiinimutantti) ja proteiini G molekyyleihin perustuvan regeneroitavan immunosensorointipinnan toistettavuuden ja vertailtavuuden. Lisäksi sensorointipinta osoitti, että proteiinien non-spesifinen sitoutuminen on erittäin vähäistä eräillä malliproteiineilla tutkittaessa. IgG-molekyylien immobisaation toimivuudesta ei kuitenkaan saatu luotettavia tuloksia. Lisäksi tutkielma esittää switchavidiinille MP-SPR mittausdataan perustuvan mekaanisen sitoutumismallin. Jatkotutkimuksissa voitaisiin keskittyä monimutkaisempien näytteiden mittaamiseen sekä kehittää esitettyyn sitoutumismalliin perustuvaa automaatiota.

Tutkielman toinen kokeellinen osuus tutki nelikanavaisen MP-SPR-prototyypin soveltuvuutta nopeasti sitoutuvien pienlääkemolekyylien sitoutumisen mittaamiseen. Ihmisen hiilihappoanhydraasi II-entsyymiä immobilisoitiin kolmiulotteiseen hydrogeelimatriksiin ja kolmen sulfonamidi-inhibiittorin sitoutumiskinetiikkaa vertailtiin referenssiartikkelin tuloksiin. Tutkimuksessa onnistuttiin mittaamaan ja analysoimaan kineettiset vakiot vain yhdestä inhibiittorista (asetatsoliamidi). Johtopäätöksenä MP-SPR-prototyyppi kykenee mittaamaan pienmolekyylien nopeaa sitoutumiskinetiikkaa, mutta tämän edellytyksenä on erittäin tarkka näytteiden ja puskureiden valmistus sekä bulkkivasteiden oikeaoppinen kalibraatio.