Avidin as an Alternative Scaffold : Development of avidin-based small molecule binding proteins, antidins

Abstract

Vasta-aineet ovat immuunipuolustusjärjestelmämme tuottamia erityisiä sitojaproteiineja, jotka kykenevät tunnistamaan lähes minkä tahansa vieraan molekyylin. Niitä onkin hyödynnetty jo melkein vuosisadan ajan sekä arvokkaina laboratorio-reagensseina biotieteissä että lääkkeinä. Viime vuosina vasta-aineisiin perustuvat reagenssit ovat saaneet haastajikseen uudenlaisia sitojaproteiineja, jotka tarjoavat tiettyihin sovelluksiin vasta-aineita parempia ominaisuuksia. Tämän väitöskirjan tavoite oli kehittää avidiinin rakenteeseen perustuvia uusia sitojaproteiineja pienmolekyyleille. Avidiini on poikkeuksellisen stabiili proteiini, joka on peräisin kananmunan valkuaisesta ja tunnetaan sen erittäin korkeasta affiniteetista luontaista ligandiaan, biotiinia, kohtaan (Kd~10-15M). Tämä on voimakkain tunnettu ei-kovalenttinen vuorovaikutus proteiinin ja sen ligandin välillä. Avidiinin rakenteen ja toiminnan välinen yhteys on hyvin tunnettu, ja proteiinin tiedetään kestävän hyvin geneettistä muokkausta, varsinkin silmukkarakenteidensa osalta. Lisäksi samaan calyciini-rakenneperheeseen avidiinin kanssa kuuluvien lipokaliinien sitomisominai-suuksia on onnistuneesti jo muokattu.

Avidiinikirjastot koottiin kohdennetun satunnaismutageneesin avulla muokkaamalla avidiinin silmukkarakenteissa sijaitsevia biotiinin sitomiseen osallistuvia aminohappotähteiteitä. Sitomisominaisuuksiltaan halutunkaltaiset avidiinivariantit valikoitiin sitten faaginäyttömenetelmän avulla. Ensimmäisenä kohdemolekyylinä toimineelle testosteronille saatiin valikoitua mikromolaarisen affiniteetin omaava sitoja. Affiniteettimaturaation avulla sen ristireaktiota biotiinille saatiin vähennettyä. Myöhemmin kolme erilaista avidiinikirjastoa yhdistettiin ja niistä seulottiin onnistuneesti erilaisia diagnostisesti merkittäviä pienmolekyylejä sitovia avidiinivariantteja, ns. antidiineja. Avidiini-rakenteen osoitettiin näin olevan muokattavissa sitomaan useampiakin erilaisia kohdemolekyylejä, joten sitä voitaisiin käyttää uusien sitojaproteiinien kehittämisessä.

Tässä väitöskirjaprojektissa kehitettiin myös kirjaston kokoamisessa käytettäviä menetelmiä. Uusi Gateway-kloonaukseen yhteensopiva phagemid-vektori (pGWphagemid) koottiin hyödyntämään bakteriofagi lambdan käyttämää homologista rekombinaatiota. Samalla suoraviivaistettiin DNA:n sekoitusmenetelmällä koottavien kimeeristen geenikirjastojen kokoamisprotokollaa, jolloin DNA-kirjaston korkea laatu ja diversiteetti saatiin paremmin säilytettyä samalla lyhentäen kirjaston kokoamisessa tarvittavaa aikaa.

Antibodies, the specific binding proteins produced by our immune system for virtually any foreign target molecule, have been used as valuable laboratory reagents in the life sciences and as therapeutic drugs in medicine for almost a century. However, in recent years these antibody-based affinity reagents have been challenged by novel types of binding proteins developed through directed evolution, offering preferable properties in certain applications. The aim of this thesis was to develop avidin scaffold-based novel binding proteins for small molecule targets, which are challenging to develop high-affinity antibodies for. Avidin is an exceptionally stable protein from chicken egg-white, known for its high affinity towards its native ligand, biotin (Kd~10-15M). This is the srongest non-covalent interaction known to nature between a protein-ligand pair. The structure-function of avidin is well known, and avidin is known to tolerate genetic modifications well, especially when located in the loop regions. Above all, lipocalins belonging to the same “calycin” superfamily as avidin, have already been successfully used as alternative scaffolds.

Avidin libraries were constructed by targeting loop region amino acid residues involved in biotin binding for randomization, and phage display was used for selection. Testosterone was chosen as the first target molecule, resulting in the selection of avidin variants, antidins, with micromolar affinities. With the help of affinity maturation, the remaining biotin-binding affinity was signicantly reduced while improving the affinity towards testosterone. Later several avidin libraries were pooled together and used for the selection of binders towards several diagnostically relevant small molecules in parallel. The obtained results showed that an avidin scaffold has potential to be used as an alternative scaffold for several small molecules.

As a result of this PhD project, new methods for library construction were established. The new Gateway-compatible phagemid (pGWphagemid) vector was constructed to enable more efficient library generation utilizing the homologous recombination of the bacteriophage lambda. Furthermore, a short-cut to the traditional DNA-shuffling protocol was introduced preserving the high quality of the DNA library while reducing time required for library construction.