Regulating the ATP Synthase Activity - Characterization of the F-ATP synthase subunit DAPIT and its over-expression in HEK293T cells
Kontro, Heidi (2017)
Kontro, Heidi
Tampere University Press
2017
Lastentautioppi - Paediatrics
Lääketieteen ja biotieteiden tiedekunta - Faculty of Medicine and Life Sciences
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Väitöspäivä
2017-05-19
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-03-0426-3
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-03-0426-3
Tiivistelmä
Tyypin 1 diabetes on monimutkainen metabolinen häiriötila, joka aiheuttaa muutoksia solun fysiologiaan, aineenvaihduntaan ja geenien ilmentymiseen. Insuliinin puutoksen tiedetään aiheuttavan hiiren kudoksissa geenisäätelyn häiriintymistä mm. laskemalla mitokondriaalisen elektroninsiirtoketjun proteiinien mRNA-tasoja. Sen sijaan energiaa tuottavan ATP-syntaasin rakenneyksiköiden ilmentyminen diabeteksessa on proteiinitasolla vielä tuntematonta, kuten ilmentymisen vaikutukset itse entsyymikompleksin aktiivisuuteenkin. Tässä väitöskirjatyössä on löydetty ja karakterisoitu ATP-syntaasin Fo kompleksin rakenneproteiini Diabetes Associated Protein in Insulin-sensitive Tissues, DAPIT. Lisäksi sen yli-ilmentymisen vaikutusta solun fysiologiaan on luonnehdittu molekyylibiologisin keinoin diabeettisen ja muun tautiyhteyden selventämiseksi.
Väitöskirja koostuu kolmesta erillisestä osatyöstä. Osatyössä I DD-PCR-, sekvensointi-, Northern blot-menetelmien sekä tietokantahaun avulla löydettiin, nimettiin ja karakterisoitiin uusi proteiini, DAPIT, tyypin 1 diabeettisen rotan insuliiniherkistä kudoksista. Osatyössä II karakterisoitiin erikoisvalmisteinen, DAPITin tunnistava vasta-aine, jonka avulla proteiinin ilmentyminen havainnollistettiin immunohistokemiallisesti useissa rotan ja ihmisen kudoksissa. Lisäksi vahvistettiin DAPITin mitokondriaalinen esiintyminen solutasolla, sekä havaittiin lysosomaalinen ilmentyminen. DAPITin ilmentymistä tutkittiin myös diabeettisen rotan ja hiiren insuliiniherkissä kudoksissa, ja havainnollistettiin sen lihassäie-spesifinen esiintyminen hiiressä. Väitöskirjan osatyössä III geenimuuntelun avulla rakennettiin DAPITia yli-ilmentävä solulinja, jonka mitokondrioita, energia-aineenvaihduntaa, morfologiaa ja käyttäytymisominaisuuksia selvitettiin.
Osatyö I tuotti uuden DAPIT-proteiinin, joka osoittautui konservoituneeksi eläinkunnassa. Terveellä rotalla proteiinin lähetti-RNA ilmeni runsaana mm. insuliiniherkissä kudoskissa. Diabeettisella rotalla lähetti-RNAn ilmentyminen oli alentunut sydämessä ja lihaksessa kontrollikudokseen verrattuna. Osatyössä II DAPITin aminohapposekvenssin karboksyylipäähän suunniteltu vasta-aine tunnisti kohteensa sekä solu- että kudostasolla. Vasta-aineen avulla nähtiin DAPITin erityinen ilmentyminen mitokondrioissa ja lysosomeissa. Aminopäähän suunniteltu vasta-aine ei ollut yhtä luotettava jokaisessa sovelluksessa. Ihmisen ja rotan kudosten immunohistokemiallisessa tutkimuksessa DAPITia esiintyi runsaasti aerobista aineenvaihduntaa hyödyntävissä insuliiniherkissä kudoksissa, sekä aktiivisesti ravinteita ja ioneja kuljettavissa epiteelirakenteissa. Diabeettisen rotan insuliiniherkkien kudosten tutkimus osoitti DAPITin proteiinitason olevan koholla, toisin kuin lähetti-RNA tasolla, sydämessä, lihaksessa ja rasvassa mutta alentunut maksassa normaaliin kudokseen verrattuna. Terveen ja diabeettisen hiiren lihaksessa eroja sen sijaan ei havaittu lihasyhdistelmän runsaan säietyyppivaihtelun vuoksi. Osatyössä III DAPITia aktivoidusti ilmentävässä solulinjassa havaittiin merkittävä mitokondriaalinen haitta proteiinin normaalia runsaamman esiintymisen seurauksena: Energiaa tuottavan ATP-syntaasin aktiivisuus laski lisääntyneestä soluhengityksestä huolimatta. Tämän seurauksena syntyi mitokondrioiden tuottamia happiradikaaleja, jotka todennäköisesti säätelivät transkriptiotekijöitä, siten edistäen anaerobista aineenvaihduntaa ja solun taantumista. Lopulta epiteelityypin solu muuntui mesenkymaaliseksi hidastaen jakautumistaan ja liikkumistaan. Geenien monistumisesta raportoiva tietokanta osoitti DAPITin lisääntyneen ilmentymisen olevan runsasta useissa syöpäsolulinjoissa ja syövissä, ehdottaen sillä olevan syöpiä edistäviä onkogeenisia ominaisuuksia.
Tämän väitöskirjan tutkimukset mahdollistivat uuden DAPIT proteiinin löytymisen insuliinipuutostilanteessa. Teetetyn vasta-aineen avulla sen ilmentyminen havainnollistettiin solu- ja kudostasolla ihmisen ja jyrsijän terveissä ja diabeettisissa kudoksissa. Normaalia runsaammin ilmentyessään DAPIT aiheuttaa ATP-syntaasin aktiivisuuden heikentymistä huolimatta hengitysketjun toiminnan aktivoitumisesta. Tämän seurauksena solun aineenvaihdunta ohjautuu glykolyysiin, mikä morfologiatasolla näkyy epiteeliominaisuuden häviämisenä. Solu taantuu monella tapaa osoittaen useita syöpien kantasolujen ominaisuuksia, joista on keskusteltu. Tutkitun solulinjan ja tyypin 1 diabeteksen lisäksi kirjallisuuden ja tietokantojen perusteella DAPITin runsasta ilmentymistä lähetti-RNA tasolla esiintyy myös muissa patofysiologissa tautimalleissa ja tiloissa, kuten Parkinsonin taudissa, multippelissa skleroosissa, painon nousussa, sydämen vajaatoiminnassa ja arseenialtistumisessa. Tämä väitöskirja yhdessä kirjallisuuden kanssa viitoittavat runsaan DAPITin ilmentämisen mahdollisesti olevan yleinen ominaisuus, joka vaikuttaa ATP-syntaasin aktiivisuuteen ja siten energiantuottoon sairauksissa ja tiloissa, joihin metaboliset häiriöt osallistuvat. Näihin kuuluvat mm. diabetes, syöpä, degeneroivat ja autoimmuunisairaudet, sekä myrkkyjen ja epigenetiikan säätelemät tilat. Kudosten ja solutyyppien patologisia muutoksia väitöskirjassa kuvatun mitokondriaalisen haitan seurauksena selventäisi geneettisellä ohjauksella DAPITia runsaasti ilmentävä hiiri, jonka karakterisoiminen mahdollistaisi yleisemmän haitan vaikutusten tunnistamisen.
Väitöskirja koostuu kolmesta erillisestä osatyöstä. Osatyössä I DD-PCR-, sekvensointi-, Northern blot-menetelmien sekä tietokantahaun avulla löydettiin, nimettiin ja karakterisoitiin uusi proteiini, DAPIT, tyypin 1 diabeettisen rotan insuliiniherkistä kudoksista. Osatyössä II karakterisoitiin erikoisvalmisteinen, DAPITin tunnistava vasta-aine, jonka avulla proteiinin ilmentyminen havainnollistettiin immunohistokemiallisesti useissa rotan ja ihmisen kudoksissa. Lisäksi vahvistettiin DAPITin mitokondriaalinen esiintyminen solutasolla, sekä havaittiin lysosomaalinen ilmentyminen. DAPITin ilmentymistä tutkittiin myös diabeettisen rotan ja hiiren insuliiniherkissä kudoksissa, ja havainnollistettiin sen lihassäie-spesifinen esiintyminen hiiressä. Väitöskirjan osatyössä III geenimuuntelun avulla rakennettiin DAPITia yli-ilmentävä solulinja, jonka mitokondrioita, energia-aineenvaihduntaa, morfologiaa ja käyttäytymisominaisuuksia selvitettiin.
Osatyö I tuotti uuden DAPIT-proteiinin, joka osoittautui konservoituneeksi eläinkunnassa. Terveellä rotalla proteiinin lähetti-RNA ilmeni runsaana mm. insuliiniherkissä kudoskissa. Diabeettisella rotalla lähetti-RNAn ilmentyminen oli alentunut sydämessä ja lihaksessa kontrollikudokseen verrattuna. Osatyössä II DAPITin aminohapposekvenssin karboksyylipäähän suunniteltu vasta-aine tunnisti kohteensa sekä solu- että kudostasolla. Vasta-aineen avulla nähtiin DAPITin erityinen ilmentyminen mitokondrioissa ja lysosomeissa. Aminopäähän suunniteltu vasta-aine ei ollut yhtä luotettava jokaisessa sovelluksessa. Ihmisen ja rotan kudosten immunohistokemiallisessa tutkimuksessa DAPITia esiintyi runsaasti aerobista aineenvaihduntaa hyödyntävissä insuliiniherkissä kudoksissa, sekä aktiivisesti ravinteita ja ioneja kuljettavissa epiteelirakenteissa. Diabeettisen rotan insuliiniherkkien kudosten tutkimus osoitti DAPITin proteiinitason olevan koholla, toisin kuin lähetti-RNA tasolla, sydämessä, lihaksessa ja rasvassa mutta alentunut maksassa normaaliin kudokseen verrattuna. Terveen ja diabeettisen hiiren lihaksessa eroja sen sijaan ei havaittu lihasyhdistelmän runsaan säietyyppivaihtelun vuoksi. Osatyössä III DAPITia aktivoidusti ilmentävässä solulinjassa havaittiin merkittävä mitokondriaalinen haitta proteiinin normaalia runsaamman esiintymisen seurauksena: Energiaa tuottavan ATP-syntaasin aktiivisuus laski lisääntyneestä soluhengityksestä huolimatta. Tämän seurauksena syntyi mitokondrioiden tuottamia happiradikaaleja, jotka todennäköisesti säätelivät transkriptiotekijöitä, siten edistäen anaerobista aineenvaihduntaa ja solun taantumista. Lopulta epiteelityypin solu muuntui mesenkymaaliseksi hidastaen jakautumistaan ja liikkumistaan. Geenien monistumisesta raportoiva tietokanta osoitti DAPITin lisääntyneen ilmentymisen olevan runsasta useissa syöpäsolulinjoissa ja syövissä, ehdottaen sillä olevan syöpiä edistäviä onkogeenisia ominaisuuksia.
Tämän väitöskirjan tutkimukset mahdollistivat uuden DAPIT proteiinin löytymisen insuliinipuutostilanteessa. Teetetyn vasta-aineen avulla sen ilmentyminen havainnollistettiin solu- ja kudostasolla ihmisen ja jyrsijän terveissä ja diabeettisissa kudoksissa. Normaalia runsaammin ilmentyessään DAPIT aiheuttaa ATP-syntaasin aktiivisuuden heikentymistä huolimatta hengitysketjun toiminnan aktivoitumisesta. Tämän seurauksena solun aineenvaihdunta ohjautuu glykolyysiin, mikä morfologiatasolla näkyy epiteeliominaisuuden häviämisenä. Solu taantuu monella tapaa osoittaen useita syöpien kantasolujen ominaisuuksia, joista on keskusteltu. Tutkitun solulinjan ja tyypin 1 diabeteksen lisäksi kirjallisuuden ja tietokantojen perusteella DAPITin runsasta ilmentymistä lähetti-RNA tasolla esiintyy myös muissa patofysiologissa tautimalleissa ja tiloissa, kuten Parkinsonin taudissa, multippelissa skleroosissa, painon nousussa, sydämen vajaatoiminnassa ja arseenialtistumisessa. Tämä väitöskirja yhdessä kirjallisuuden kanssa viitoittavat runsaan DAPITin ilmentämisen mahdollisesti olevan yleinen ominaisuus, joka vaikuttaa ATP-syntaasin aktiivisuuteen ja siten energiantuottoon sairauksissa ja tiloissa, joihin metaboliset häiriöt osallistuvat. Näihin kuuluvat mm. diabetes, syöpä, degeneroivat ja autoimmuunisairaudet, sekä myrkkyjen ja epigenetiikan säätelemät tilat. Kudosten ja solutyyppien patologisia muutoksia väitöskirjassa kuvatun mitokondriaalisen haitan seurauksena selventäisi geneettisellä ohjauksella DAPITia runsaasti ilmentävä hiiri, jonka karakterisoiminen mahdollistaisi yleisemmän haitan vaikutusten tunnistamisen.
Kokoelmat
- Väitöskirjat [4945]