The effect of boron containing bioactive glasses and glass extracts on the attachment, proliferation and osteogenic differentiation of human adipose stem cells
Larionova, Antonina (2017)
Tässä tietueessa ei ole kokotekstiä saatavilla Treposta, ainoastaan metadata.
Larionova, Antonina
2017
Bioteknologian tutkinto-ohjelma - Degree Programme in Biotechnology
Lääketieteen ja biotieteiden tiedekunta - Faculty of Medicine and Life Sciences
Hyväksymispäivämäärä
2017-01-16
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:uta-201702141151
https://urn.fi/URN:NBN:fi:uta-201702141151
Tiivistelmä
ABSTRACT
Background and aims: Human adipose stem cells (hASCs) are mesenchymal multipotent stem cells that have the capacity to differentiate toward multiple cell lineages, such as chondro-, adipo- and osteogenic cell lineages. Due to these properties, hASCs are a suitable cell type for bone tissue engineering. Currently used biomaterials do not always meet the demands of bone loss fixation, due to limitations concerning mechanical properties or osteoinductivity. Used in this research paper boron containing bioactive glasses (BaGs) have improved manufacturing properties and tailorable degradation rate. Together with hASCs they may be applied as bone tissue engineering scaffolds. In the first part of the study boron containing BaG discs were researched in order to evaluate the ability of glass surface to support the viability, proliferation and osteogenic differentiation of hASCs. In the second part of the study the effects of the dissolution products of boron containing BaGs were evaluated.
Methods: The viability of hASCs was assessed by Live/dead -staining at several time points of cell culture (3-25d). Cell proliferation was evaluated by quantifying total DNA amount of samples at several time points (3-21d). Osteogenic differentiation was analyzed by quantitative alkaline phosphatase activity (qALP) assay after 7, 14 and 21 days in culture and Alizarin Red S -staining in BaG extract experiment at 19 and 25 days time points. In addition, osteogenic differentiation was assessed by analysis of protein production of late osteogenic differentiation marker, osteocalcin (OCN), by immunocytochemistry after 19 and 25 days in culture. BaG extracts were designated B1, B2 and B3 according to their boron concentration. B1: 50 micrograms/ml, B2: 5 micrograms/ml and B3: 0.5 micrograms/ml.
Results: Boron containing BaG discs compromised cell viability, cell attachment and proliferation on the glass surface in basic (BM) and osteogenic media (OM). Osteogenic differentiation couldn t be observed in neither of the media condition. Boron containing BaG extracts supported cell proliferation for the whole culturing period in BM and OM, except B1 BaG extract, which inhibited proliferation significantly (p<0.05). B3 BaG extract elevated ALP activity levels (p<0.05) in OM, whereas late osteogenic differentiation was more pronounced in B1 BaG extract than in B2 and B3 extracts. OCN immunocytochemical staining also con- firmed the osteogenic differentiation of hASCs in B1 BaG extract. Cell morphology was simi- lar in boron containing BaG discs and B1 BaG extract in BM and OM.
Conclusions: Dissolution products of boron containing BaGs exhibited ability to promote viability, proliferation and osteogenic differentiation of hASCs. Particularly B1 BaG extract provided the most favorable conditions for osteogenic differentiation. However, further research is needed to confirm osteogenic differentiation of hASCs in boron containing BaG extracts. Boron containing BaG discs with the used composition need further tailoring in order to use them with hASCs in bone tissue engineering applications.
TIIVISTELMÄ
Tausta ja tavoitteet: Rasvakudoksen kantasolut ovat monikykyisiä mesenkymaalisia kantasoluja, joilla on kyky erilaistua moneksi eri solutyypiksi, kuten rusto-, rasva-, ja luusoluiksi. Tähän kykyyn perustuen rasvakudoksen kantasoluja voidaan käyttää luun kudosteknologian sovelluksiin. Nykyään käytetyillä biomateriaaleilla luun kudosteknologiassa on useampia rajoituksia koskien riittämättömiä mekaanisia tai luuerilaistumista edistäviä ominaisuuksia. Tässä tutkimuksessa käytetyillä booria sisältävillä bioaktiivisilla laseilla on parempia muokattavuusominaisuuksia ja lisäksi, ne mahdollistavat paremman hajoamisnopeuden säätelyn. Näillä laseilla rasvakudoksen kantasolujen kanssa saattaisi olla potentiaalia luun kudosteknologian sovelluksissa. Työn ensimmäisessä osassa käsiteltiin booria sisältävien bioaktiivisten lasilevyjen vaikutusta rasvakudoksen kantasolujen elinkykyyn, lisääntymiseen ja luuerilaistumiseen. Työn toisessa osassa määriteltiin bioaktiivisista laseista vapautuvien ionien vaikutusta rasvakudoksen kantasoluihin.
Menetelmät: Rasvakudoksen kantasolujen elinkykyä booria sisältävien bioaktiivisten lasien pinnalla ja bioaktiivisten lasien ionien läsnäollessa arvioitiin elävien ja kuolleiden solujen värjäytymisellä eri aikapisteissä (3-25pv). Solukasvua analysoitiin määrittämällä näytteiden DNA-määrä useissa aikapisteissä (3-25pv). Solujen luuerilaistumista analysoitiin määrällisellä alkalisen fosfataasin aktiivisuuden määrityksellä (7, 14 ja 21 pv aikapisteissä) ja mineraalia tunnistavalla Alizarin red S-menetelmällä bioaktiivisten lasien ekstrakteissa 19 ja 25 pv kohdalla. Lisäksi luuerilaistumista tutkittiin analysoimalla kvalitatiivisesti myöhäisen luuerilais- tumismarkkerin, osteokalsiinin, ilmentyvyyttä proteiinitasolla immunosytokemiallisen menetelmän avulla. Booria sisältävien lasien ekstraktit nimettiin B1, B2 ja B3 niiden boorikonsentraatioiden perusteella siten, että B1: 50 mikrogrammaa/ml, B2: 5 mikrogrammaa/ml and B3: 0.5 mikrogrammaa/ml.
Tulokset: Booria sisältävät bioaktiiviset lasilevyt inhiboivat solujen elinkykyä ja häiritsivät solujen kiinnittymistä ja lisääntymistä lasipinnalla tavallisessa (BM) ja luuerilaistumista edistävässä meediumissa (OM). Luuerilaistumista ei havaittu. Booria sisältävien lasien ekstraktit tukivat solujen elinkykyä ja lisääntymistä koko soluviljelyn ajan BM- ja OM-olosuhteissa, lukuun ottamatta B1-ekstraktia, joka inhiboi solujen kasvua merkittävästi (p<0.05). OM- olosuhteissa B3 lisäsi alkalisen fosfataasin aktiivisuutta merkittävästi (p<0.05), mutta B1 ekstraktissa mineraalintuotto oli korkeampi, kuin B2 ja B3 näytteissä. Osteokalsiinin määrä oli myös kohonnut B1-näytteessä OM-olosuhteissa, mikä tukee luuerilaistumisen tulosta. Solumorfologia oli samankaltainen lasilevyillä ja B1-ekstraktissa BM ja OM-olosuhteissa. Johtopäätökset: Booria sisältävien bioaktiivisten lasien ionit osoittautuivat ihmisen rasvakudoksen kantasolujen kasvua ja elinkykyä tukeviksi tekijöiksi. B1 osoittautui suotuisaksi luuerilaistumisen kannalta. Luuerilaistumisen osoittaminen kuitenkin vaatii lisää näyttöä. Tuloksemme osoittivat, että booria sisältävien bioaktiivisten lasien sisältöä täytyy muokata edelleen, jotta laseja pystytään tulevaisuudessa hyödyntämään paremmin rasvakudoksen kantasolujen kanssa kudosteknologisissa sovelluksissa.
Background and aims: Human adipose stem cells (hASCs) are mesenchymal multipotent stem cells that have the capacity to differentiate toward multiple cell lineages, such as chondro-, adipo- and osteogenic cell lineages. Due to these properties, hASCs are a suitable cell type for bone tissue engineering. Currently used biomaterials do not always meet the demands of bone loss fixation, due to limitations concerning mechanical properties or osteoinductivity. Used in this research paper boron containing bioactive glasses (BaGs) have improved manufacturing properties and tailorable degradation rate. Together with hASCs they may be applied as bone tissue engineering scaffolds. In the first part of the study boron containing BaG discs were researched in order to evaluate the ability of glass surface to support the viability, proliferation and osteogenic differentiation of hASCs. In the second part of the study the effects of the dissolution products of boron containing BaGs were evaluated.
Methods: The viability of hASCs was assessed by Live/dead -staining at several time points of cell culture (3-25d). Cell proliferation was evaluated by quantifying total DNA amount of samples at several time points (3-21d). Osteogenic differentiation was analyzed by quantitative alkaline phosphatase activity (qALP) assay after 7, 14 and 21 days in culture and Alizarin Red S -staining in BaG extract experiment at 19 and 25 days time points. In addition, osteogenic differentiation was assessed by analysis of protein production of late osteogenic differentiation marker, osteocalcin (OCN), by immunocytochemistry after 19 and 25 days in culture. BaG extracts were designated B1, B2 and B3 according to their boron concentration. B1: 50 micrograms/ml, B2: 5 micrograms/ml and B3: 0.5 micrograms/ml.
Results: Boron containing BaG discs compromised cell viability, cell attachment and proliferation on the glass surface in basic (BM) and osteogenic media (OM). Osteogenic differentiation couldn t be observed in neither of the media condition. Boron containing BaG extracts supported cell proliferation for the whole culturing period in BM and OM, except B1 BaG extract, which inhibited proliferation significantly (p<0.05). B3 BaG extract elevated ALP activity levels (p<0.05) in OM, whereas late osteogenic differentiation was more pronounced in B1 BaG extract than in B2 and B3 extracts. OCN immunocytochemical staining also con- firmed the osteogenic differentiation of hASCs in B1 BaG extract. Cell morphology was simi- lar in boron containing BaG discs and B1 BaG extract in BM and OM.
Conclusions: Dissolution products of boron containing BaGs exhibited ability to promote viability, proliferation and osteogenic differentiation of hASCs. Particularly B1 BaG extract provided the most favorable conditions for osteogenic differentiation. However, further research is needed to confirm osteogenic differentiation of hASCs in boron containing BaG extracts. Boron containing BaG discs with the used composition need further tailoring in order to use them with hASCs in bone tissue engineering applications.
TIIVISTELMÄ
Tausta ja tavoitteet: Rasvakudoksen kantasolut ovat monikykyisiä mesenkymaalisia kantasoluja, joilla on kyky erilaistua moneksi eri solutyypiksi, kuten rusto-, rasva-, ja luusoluiksi. Tähän kykyyn perustuen rasvakudoksen kantasoluja voidaan käyttää luun kudosteknologian sovelluksiin. Nykyään käytetyillä biomateriaaleilla luun kudosteknologiassa on useampia rajoituksia koskien riittämättömiä mekaanisia tai luuerilaistumista edistäviä ominaisuuksia. Tässä tutkimuksessa käytetyillä booria sisältävillä bioaktiivisilla laseilla on parempia muokattavuusominaisuuksia ja lisäksi, ne mahdollistavat paremman hajoamisnopeuden säätelyn. Näillä laseilla rasvakudoksen kantasolujen kanssa saattaisi olla potentiaalia luun kudosteknologian sovelluksissa. Työn ensimmäisessä osassa käsiteltiin booria sisältävien bioaktiivisten lasilevyjen vaikutusta rasvakudoksen kantasolujen elinkykyyn, lisääntymiseen ja luuerilaistumiseen. Työn toisessa osassa määriteltiin bioaktiivisista laseista vapautuvien ionien vaikutusta rasvakudoksen kantasoluihin.
Menetelmät: Rasvakudoksen kantasolujen elinkykyä booria sisältävien bioaktiivisten lasien pinnalla ja bioaktiivisten lasien ionien läsnäollessa arvioitiin elävien ja kuolleiden solujen värjäytymisellä eri aikapisteissä (3-25pv). Solukasvua analysoitiin määrittämällä näytteiden DNA-määrä useissa aikapisteissä (3-25pv). Solujen luuerilaistumista analysoitiin määrällisellä alkalisen fosfataasin aktiivisuuden määrityksellä (7, 14 ja 21 pv aikapisteissä) ja mineraalia tunnistavalla Alizarin red S-menetelmällä bioaktiivisten lasien ekstrakteissa 19 ja 25 pv kohdalla. Lisäksi luuerilaistumista tutkittiin analysoimalla kvalitatiivisesti myöhäisen luuerilais- tumismarkkerin, osteokalsiinin, ilmentyvyyttä proteiinitasolla immunosytokemiallisen menetelmän avulla. Booria sisältävien lasien ekstraktit nimettiin B1, B2 ja B3 niiden boorikonsentraatioiden perusteella siten, että B1: 50 mikrogrammaa/ml, B2: 5 mikrogrammaa/ml and B3: 0.5 mikrogrammaa/ml.
Tulokset: Booria sisältävät bioaktiiviset lasilevyt inhiboivat solujen elinkykyä ja häiritsivät solujen kiinnittymistä ja lisääntymistä lasipinnalla tavallisessa (BM) ja luuerilaistumista edistävässä meediumissa (OM). Luuerilaistumista ei havaittu. Booria sisältävien lasien ekstraktit tukivat solujen elinkykyä ja lisääntymistä koko soluviljelyn ajan BM- ja OM-olosuhteissa, lukuun ottamatta B1-ekstraktia, joka inhiboi solujen kasvua merkittävästi (p<0.05). OM- olosuhteissa B3 lisäsi alkalisen fosfataasin aktiivisuutta merkittävästi (p<0.05), mutta B1 ekstraktissa mineraalintuotto oli korkeampi, kuin B2 ja B3 näytteissä. Osteokalsiinin määrä oli myös kohonnut B1-näytteessä OM-olosuhteissa, mikä tukee luuerilaistumisen tulosta. Solumorfologia oli samankaltainen lasilevyillä ja B1-ekstraktissa BM ja OM-olosuhteissa. Johtopäätökset: Booria sisältävien bioaktiivisten lasien ionit osoittautuivat ihmisen rasvakudoksen kantasolujen kasvua ja elinkykyä tukeviksi tekijöiksi. B1 osoittautui suotuisaksi luuerilaistumisen kannalta. Luuerilaistumisen osoittaminen kuitenkin vaatii lisää näyttöä. Tuloksemme osoittivat, että booria sisältävien bioaktiivisten lasien sisältöä täytyy muokata edelleen, jotta laseja pystytään tulevaisuudessa hyödyntämään paremmin rasvakudoksen kantasolujen kanssa kudosteknologisissa sovelluksissa.