BMP4 in Breast Cancer Growth and Metastasis with Insights into Transcriptional Regulation

Abstract

Rintasyöpä on maailmanlaajuisesti naisten yleisin syöpä. Luun morfogeneettiset proteiinit (bone morphogenetic protein, BMP) ovat signalointimolekyylejä, jotka ovat usein syövässä poikkeavalla tavalla säädeltyjä. BMP4:n on aiemmin näytetty hidastavan rintasyöpäsolujen kasvua ja joissakin tapauksissa samalla lisäävän niiden migraatiokykyä. Nämä tutkimukset on kuitenkin tehty standardimallisessa 2D kasvatuksessa. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia BMP4:n vaikutusta rintasyöpäsoluihin 3D- ja in vivo -malleissa, sekä lisäksi tutkia BMP4-reitin kohdegeenejä ja signaalinsäätelyä.

Usean eri rintasyöpäsolulinjan soluja kasvatettiin sekä synteettisessä PEG geelissä että biologisesta lähteestä saadussa Matrigeelissä. BMP4 hidasti solujen kasvua molemmissa materiaaleissa. Kasvun laskua tutkittiin lähemmin Matrigeelissä ja efektin todettiin johtuvan osittain p21 induktiosta. Lisäksi MDA-MB-231 rintasyöpäsolut Matrigeelissä muodostivat BMP4:n vaikutuksesta isoja haarautuvia rakenteita, jotka viittaavat lisääntyneeseen migraatioon/invaasioon. Tämä reaktio oli matriksin metalloproteinaaseista riippuvainen.

BMP4:n aiheuttamaa migraatio/invaasioefektiä tutkittiin tarkemmin käyttämällä hiirimallia ja seuraamalla BMP4:n kykyä vaikuttaa metastaasien muodostukseen. Hiirten sydämiin injektoitiin MDA-MB-231 soluja ja niitä käsiteltiin BMP4:llä tai vehikkelikontrollilla. BMP4-käsitellyissä hiirissä oli jonkin verran enemmän luumetastaaseja, mutta vähemmän lisämunuaismetastaaseja kuin vehikkeliryhmässä. Metastaaseista tutkittiin BMP signaloinnin aktivoitumista, kasvua, epiteeli-mesenkymaalitransitiota sekä verisuonia ja syöpään liittyviä fibroblasteja (cancer-associated fibroblasts). Eroa ryhmien välillä ei kuitenkaan ollut. Mielenkiintoista oli että molemmissa ryhmissä löytyi osteoklastimarkkerin värjäytymistä syöpäsolujen joukosta.

BMP4:n signaloinnin tutkimusta varten MDA-MB-231 ja T-47D rintasyöpäsoluja käsiteltiin BMP4:llä tai vehikkelillä ja analysoitiin geenien ilmentymiseroja (RNA-seq) ja genomissa olevia säätelyalueita (DNaasi-seq). RNA-seq data osoitti solulinjojen olevan keskenään hyvin erilaisia, vaikka myös yhteisiä BMP4 kohdegeenejä löytyi. Rikastumisanalyysi paljasti, että MDA-MB-231 soluissa, jotka reagoivat BMP4:ään lisääntyneellä migraatiolla, liikkumiseen liittyvät geenit olivat rikastuneet. Vastaavasti T-47D soluissa, joissa tapahtuu kasvun hidastuminen BMP4:n vaikutuksesta, kehitykseen ja signalointiin liittyvät geenit olivat rikastuneet. Samanlaiset tulokset saatiin kun analysoitiin BMP4:n aiheuttamien avoimen kromatiinin alueiden rikastumista. Lisäksi avoimen kromatiinin analysoinnin avulla valittiin kolme transkriptiotekijää, MBD2, CBFB ja HIF1A, joiden validoitiin funktionaalisten siRNA-kokeiden perusteella olevan BMP4-reitin alavirran säätelijöitä. Näistä MBD2 toimi säätelyn aktivaattorina molemmissa solulinjoissa, CBFB T-47D soluissa ja HIF1A toimi repressorina MDA-MB-231 soluissa.

Yhteenvetona BMP4:llä on kasvua vähentäviä ja migraatiota lisääviä vaikutuksia sekä 2D että 3D kasvatuksissa, mutta lisätutkimuksia tarvitaan selventämään BMP4:n osuutta metastaasien muodostuksessa, erityisesti luumetastaaseissa. BMP4:n aiheuttamat muutokset heijastuvat geenien ilmentymiseen ja kromatiinin aukeamiseen. Lisäksi muutoksista riippuen eri transkriptiotekijät vaikuttavat säätelevän BMP4:n kohdegeenejä.

Breast cancer is the most common cancer in women worldwide. The bone morphogenetic proteins (BMPs) are signaling molecules that are often aberrantly regulated in cancer. BMP4 has previously been shown to reduce the proliferation of breast cancer cells and in some cases increase their migration. However, these studies have been done using standard 2D culture. The aim of this study was to characterize the effect of BMP4 on breast cancer cells in 3D culture and using an in vivo model, as well as to study BMP4 target genes and signaling pathway regulation.

Several different breast cancer cell lines were grown in both the synthetic PEG gel and biologically-derived Matrigel. BMP4 inhibited the proliferation of cells in both materials. The growth inhibition was examined more closely in Matrigel, showing that the effect was partly due to p21 induction. In addition, in response to BMP4 MDA-MB-231 breast cancer cells in Matrigel formed large, branching structures, indicative of increased migration/invasion. This reaction was dependent on matrix metalloproteinases.

The migration/invasion effect promoted by BMP4 was examined in more detail by using a mouse model and following the effects of BMP4 on metastasis formation. The mice were injected intracardially with MDA-MB-231 cells and treated with BMP4 or vehicle control. The mice treated with BMP4 had slightly more bone metastases, but less adrenal gland metastases compared to the vehicle group. The activation of BMP signaling, epithelial-to-mesenchymal transition, as well as blood vessels and cancer-associated fibroblasts were studied from the metastases. However, there were no differences between the treatment groups. Interestingly, in both groups osteoclast marker staining was found among the cancer cells.

In order to study BMP4 signaling, MDA-MB-231 and T-47D breast cancer cells were treated with BMP4 or vehicle and differences in gene expression (RNA-seq) and in regulatory regions of the genome (DNase-seq) were analyzed. RNA-seq data showed that the responses of the cell lines to BMP4 were different, although there were also common BMP4 target genes, which were also target genes in additional cell lines when tested with qPCR. Enrichment analysis revealed that in MDA-MB-231 cells, which react to BMP4 with increased migration, motility-related genes were enriched. Correspondingly, in T-47D cells, which respond with reduced proliferation, genes related to development and signaling were enriched. Similar results were obtained when analyzing enrichment of chromatin regions that were opened due to BMP4 treatment. Moreover, based on the open chromatin regions, three transcription factors (MBD2, CBFB and HIF1A) were chosen for functional analyses using siRNA and validated as BMP4 downstream regulators. Of these, MBD2 was mainly an activator in both cell lines, CBFB in T-47D cells and HIF1A acted as a repressor in MDA-MB-231 cells.

Taken together, BMP4 inhibits proliferation and increases migration in both 2D and 3D culture, but more studies are needed to clarify the role of BMP4 in metastasis formation, particularly in bone metastases. The effects of BMP4 are reflected in gene expression and chromatin openness. Additionally, depending on the effects different transcription factors seem to regulate BMP4 target genes.