Biological effects of coeliac disease patient antibodies in vivo

Abstract

Keliakialle on ominaista, että ravinnosta saatava vehnän, ohran ja rukiin gluteeni aiheuttaa autoimmuunivasteen geneettisesti alttiissa yksilössä. Osana tätä prosessia on keliakia-spesifisten vasta-aineiden muodostuminen. Nämä vasta-aineet kohdistuvat pääosin transglutaminaasi 2 (TG2)-entsyymiä vastaan ja niitä löytyy sekä potilaiden verenkierrosta että kerääntyminä ohutsuolen limakalvolta jo taudin varhaisessa vaiheessa. Yleensä kyseiset autovasta-aineet kuuluvat immunoglobuliini (Ig) A-luokkaan, mutta mikäli kyseessä on IgA-puutoksinen keliakiapotilas, verenkierrossa olevat TG2-autovasta-aineet ovat IgG-luokkaa ja suolen vasta-ainekerääntymät IgM-luokkaa. Keliakialle yleistä on myös immuunireaktion aiheuttama ohutsuolen limakalvovaurio, joka kehittyy asteittain lievän tulehduksen kautta lopulta suolikuopakkeiden liikakasvuun ja nukkalisäkkeiden tuhoutumiseen. Mielenkiintoista kyllä, keliakiapotilailla on havaittu muutoksia myös ohutsuolen verisuonistossa, joka toimii tärkeänä mekaanisena tukena suolinukan rakenteelle. Taudin kliininen kuva on hyvin vaihteleva. Potilas saattaa olla täysin oireeton, hänellä voi olla gastrointestinaalisia oireita kuten ripulia ja vatsakipuja tai täysin suolen ulkopuolisia ongelmia esimerkiksi maksassa, lihaksissa tai aivoissa. Potilaalla saattaa olla yllämainittuja oireita jo ohutsuolen limakalvon rakenteen ollessa vielä normaali.

Monissa solutason tutkimuksissa on osoitettu, että TG2-autovasta-aineilla on biologisia vaikutuksia, mutta tästä huolimatta niiden osallisuudesta taudin syntyyn ei ole ollut lopullista selvyyttä. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena on näyttää keliakiavasta-aineiden ja erityisesti TG2-autovasta-aineiden mahdollisia vaikutuksia taudin syntyyn elävän eliön tasolla. Työt I ja II toteutettiin menetelmällä, jossa IgA-puutoksisilta keliakiapotilailta peräisin olevaa seerumia, seerumista puhdistettua IgG-fraktiota (I) tai soluviljelmissä tuotettuja keliakia-potilailta peräisin olevia TG2-autovasta-aineita (II) injektoitiin hiiriin, joilla ei ole T-soluja. Työssä III tutkittiin TG2-autovasta-aineitten vaikutusta verisuonten muodostumiseen ja toimivuuteen soluilla sekä elävässä kudoksessa ja eliössä matrigeelin käyttöön perustuvalla menetelmällä.

Töissä I ja II havaittiin, että keliakiapotilailta peräisin olevalla seerumilla, IgG-fraktiolla tai TG2-autovasta-aineilla injektoiduilla hiirillä oli lieviä mutta kuitenkin tilastollisesti merkittäviä muutoksia ohutsuolen limakalvorakenteessa. Kyseisillä hiirillä oli myös lisääntynyt määrä soluja ohutsuolen lamina propriassa eli tukikalvolla, joka sijaitsee limakalvon epiteelikerroksen alla. Lisäksi ohutsuolesta löytyi TG2-autovasta-ainekertymiä. Mitään yllämainituista piirteistä ei havaittu kontrollieläimillä. Mielenkiintoista oli, että työssä I hiirillä, joihin injektoitiin keliaakikkojen seerumia tai IgG-fraktiota, esiintyi lievää ripulia enemmän kuin kontrolleilla ja painon kehitys oli hidastunut.

Työssä II vastaavia eroja ryhmien välillä ei havaittu. Työssä III osoitettiin, että keliaakikoilta peräisin olevat vasta-aineet estävät verisuonten syntymistä elävässä kudoksessa. Solutason kokeissa solujen havaittiin liikkuvan vähemmän keliakiavasta-aineiden läsnäollessa verrattuina kontrolleihin. Lisäksi keliakia-vasta-aineilla käsitellyt hiiren kudoksesta lähtöisin olevat solut eivät kyenneet muodostamaan vaeltamiseen tarvittavia ulkonemia. Saattaakin olla, että solujen puutteellinen kyky vaeltaa myötävaikutti kyseisissä hiirissä havaittuun vähentyneeseen verisuonten muodostumiseen. Keliakia-vasta-aineet myös heikensivät verisuonten toimivuutta.

Tässä väitöskirjatyössä siis löydettiin ensimmäistä kertaa TG2-autovasta-aineita kerääntyminä hiiren ohutsuolen limakalvolta. Lisäksi tärkeä löydös oli, että vasta-ainekertymät olivat hiiren ohutsuolessa yhtäaikaisesti suolivaurion kanssa. Näiden hiirten tila, joihin injektoitiin keliaakikoiden seerumia, IgG-fraktiota tai TG2-autovasta-aineita, muistutti alkavaa keliakiaa ihmisillä.

Tämän työn tulosten perusteella on mahdollista, että lisääntynyt solumäärä lamina propriassa samoin kuin lievästi nousseet sytokiinitasot (tuumorinekroositekijä-α, TNF-α, ja interleukiini-27, IL-27) työssä II saattavat vaikuttaa ohutsuolen limakalvon vaurion kehittymiseen. Työn III tulokset näyttivät selvästi vasta-aineiden häiritsevän uusien verisuonten syntymistä ja kehittymistä ja näin ollen voitaisiin ajatella, että myös vasta-ainekertymät myötävaikuttavat nukkalisäkkeiden tuhoutumiseen heikentämällä verisuonistoa ja sen myötä verisuoniston nukkalisäkkeille tuomaa mekaanista tukea. Lisäksi tämän työn tulokset viittaavat siihen, että työssä II käytettyjen TG2-autovasta-aineiden lisäksi keliakian kliinisten oireiden syntyminen vaatii myös TG2-autovasta-aineita, jotka kohdistuvat muita TG2-epitooppeja kohtaan, kokonaan muita vasta-ainepopulaatioita tai/ja pidempää altistumisaikaa vasta-aineille. Kaiken kaikkiaan, tämä väitöskirjatyö paljastaa uusia keliakia-spesifisten TG2-autovasta-aineiden biologisia vaikutuksia.

In coeliac disease, dietary gluten from wheat, barley and rye induces an autoimmune reaction in genetically susceptible individuals. This involves the formation of coeliac disease-specific antibodies targeting mainly transglutaminase 2 (TG2). TG2 autoantibodies are present both in the circulation and as deposits in the small-intestinal mucosa already in very early phases of the disease. Usually these autoantibodies belong to immunoglobulin (Ig) class A, but IgA deficient coeliac patients have IgG class antibodies in their circulation, and IgM antibodies have been found in the small-intestinal mucosa. Typically patients also evince small-bowel mucosal damage which develops gradually from normal villous morphology to inflammation and finally to crypt hyperplasia and villous atrophy. Furthermore, it has been shown that coeliac patients evince abnormalities in small-intestinal vasculature, which supplies an essential mechanical support for the villous structure. The clinical presentation of the disease is variable, ranging from asymptomatic to classical intestinal manifestations such as diarrhoea and abdominal pain, and even to extraintestinal symptoms in different organs involving for instance liver, skin, muscles and brain. Interestingly, many of these have been reported to occur while the small-intestinal morphology is still normal.

Many studies have shown that TG2 autoantibodies have biological effects in vitro, but there is controversy as to their contribution to the disease pathogenesis. The present work aimed to demonstrate in vivo effects of coeliac disease patient antibodies and especially TG2-targeted autoantibodies relevant to the pathogenesis of the disease. Studies I and II were conducted using a passive transfer method, where either sera or serum total IgG fraction from IgA deficient coeliac disease patients (I) or patient-derived recombinantly produced TG2 autoantibodes (II) were injected into mice lacking T cells. In study III, in vitro, ex vivo and in vivo matrigel assays were utilized to investigate the effects of TG2 autoantibodies on vascular formation and functionality.

In studies I and II, mice receiving coeliac patient-derived sera, total IgG or monoclonal TG2 autoantibodies evinced a slight, albeit significant, deterioration of the mucosal morphology in the small intestine. In addition, an increased density of infiltrative cells in the lamina propria was observed. Autoantibody deposits targeted to TG2 were also found in the small-intestinal mucosa of the mice. None of these features was observed in control mice. Interestingly, an increased occurrence of mild diarrhoea and delayed weight gain was observed in a subset of the mice injected with coeliac patient sera or total IgG in study I. In contrast, in study II, injections of TG2 autoantibodies led to no such difference in the occurrence of mild diarrhoea between groups and the weights of the mice were fairly stable throughout the study period. The results from study III clearly showed that coeliac patient-derived antibodies inhibited angiogenesis in vitro, ex vivo and in vivo. In in vitro studies the cells were less mobile in the presence of coeliac antibodies compared to controls and ex vivo results further revealed that, in the presence of coeliac patient TG2-targeted autoantibodies, cells outgrowing from mouse aortas were round and did not exhibit cellular processes characteristic for the leading edge during migration as in controls. Thus it might be assumed that inhibited angiogenesis is accounted for defective cell migration. In addition, the in vivo study revealed impaired functionality of vessels in the presence of coeliac antibodies.

For the first time, TG2 targeted autoantibody deposits were shown in the small-intestinal mucosa of mice. Importantly, autoantibody deposits occur in conjunction with mild enteropathy in mice. The condition of mice receiving coeliac patient-derived sera, total IgG or TG2 autoantibodies resembled early-phase disease in coeliac patients. Based on the data from the present study, it seems conceivable that an increased density of inflammatory cells in the lamina propria, together with the slightly increased levels of tumor necrosis factor (TNF)-α and interleukin (IL)-27 seen in study II, may contribute to small-intestinal mucosal deterioration and thus play a role in the pathogenesis of coeliac disease. In addition, study III revealed the anti-angiogenic effects of coeliac TG2 autoantibodies and thus it may be assumed that small-intestinal deposits may contribute to the development of villous atrophy by impairing the intestinal vascularity and leaving the villi without proper mechanical support. The results from the present study would also imply that the development of clinical features requires, in addition to the TG2 autoantibodies used in the present study, also TG2 autoantibodies targeting other epitopes in TG2, entirely other antibody populations and/or longer exposure to the antibodies. Altogether, this study provided new evidence on the biological effects of coeliac disease-specific autoantibodies in vivo.