Hydrogel Screening for 3D Vascular Model on Microfluidic Chip

Abstract

Hydrogels are biomaterials which consist of crosslinked polymer networks, and they have ability to absorb large amounts of water. In addition, hydrogels allow perfusion and give structural support to the cells. Hydrogels are crucial element for three-dimensional (3D) cell models since they mimic the cells’ natural 3D environment, extracellular matrix (ECM). In addition, 3D cell models mimic native tissues better than 2D models and thus are better models for studying human physiology. Vasculature is responsible for transport of oxygen, nutrients and metabolites and is therefore essential for all living tissues in human body. Overall, both hydrogels and vasculature are essential when creating organotypic in vitro models such as Organ-on-Chip and even Body-on-Chip applications. This study focused on analyzing hydrogel size change, including degradation, and shrinking or swelling, by measuring the size of the samples in vitro during cultivation, testing protease inhibitors’ effects on hydrogel’s degradation or size change, and using these hydrogels (± inhibitors) to support 3D vascularization on microfluidic chip, that is Vascularization-on-a-Chip. The tested hydrogels included fibrin (human), collagen I (rat tail), VitroCol® (human collagen I), TeloCol® (bovine Telocollagen I), gelatin-gellan gum (porcine skin, bacterial) and VitroGel® (xeno-free). First, human lung fibroblasts (WI-38) were cultured embedded in hydrogels for 10 days. The size change of the hydrogels was measured every day during cultivation period. The area of the samples was measured with tile scan imaging, and the thickness was measured by imaging fluorescent beads embedded in the hydrogels, and volume was calculated based on these measured values. Cell viability and morphology were analyzed with Live/Dead and cytochemical staining. In microfluidic chips, human bone marrow stem/stromal cells (BMSCs), and green fluorescent protein (GFP) tagged human umbilical vein endothelial cells (GFP-HUVECs) were cultured inside a hydrogel for 10 days in dynamic conditions. The cellular reorganization, vascularization and cell morphology were analyzed by imaging signals of GFP and immunocytochemical staining. Hydrogels in static conditions in a well plate showed varying characteristics in both sample size changes and cell morphology including elongation and spreading of the cells. Functional inhibitors preventing the decrease in size or degradation of the tested hydrogels were discovered during the study. In microfluidic chip experiments with dynamic culture conditions, the inhibitors supported 3D vascularization. Vascular network formed in fibrin hydrogel appeared to be more mature compared to vascular network formed in other hydrogels. In conclusion, a method to analyze hydrogel size change by using fluorescent bead imaging was created, the hydrogel degradation was decreased with inhibitors and fibrin showed to be the most promising hydrogel to support 3D vasculature maintenance on-chip.

Hydrogeelit ovat biomateriaaleja, jotka koostuvat verkkomaisista polymeerirakenteista ja joilla on kyky absorboida suuri määrä vettä itseensä. Lisäksi hydrogeelit mahdollistavat perfuusion eli nesteen virtaamisen niiden läpi. Hydrogeelit myös antavat soluille niiden tarvitseman tuen ja toimivat niiden kolmiulotteisena (3D) tukirakenteena. Hydrogeelit ovat tärkeitä 3D-solumalleille, koska ne muistuttavat monien ihmiskudosten luonnollista soluväliainetta. Tämän takia hydrogeelejä sisältävät 3D-solumallit myös muistuttavat enemmän luonnollisia kudoksia kuin 2D-mallit ja vastaavat siten paremmin ihmisen fysiologiaa. Verisuonisto vastaa muun muassa hapen, ravinteiden ja aineenvaihduntatuotteiden kuljettamisesta ja on siten elintärkeä osa ihmiskehoa. Tämän takia sekä hydrogeelit että verisuonisto ovat tärkeitä osia kudoksenkaltaisien solumallien kuten kudossirujen (eng. Organ-on-Chip) ja jopa laajempia elimistön kokonaisuuksia jäljittelevien monikudossirujen (eng. Body-on-Chip) kehityksessä. Tässä diplomityössä hydrogeelien koon muutosta, kutistumista tai hajoamista, analysoitiin mittaamalla näytteen kokoa soluviljelyn aikana. Lisäksi tutkittiin proteaasi-inhibiittoreiden vaikutuksia hydrogeelin koon muutokseen ja verisuonien muodostumiseen käyttämällä hydrogeelejä sekä inhibiittorien kanssa että ilman verisuonimallissa kudossirulla. Tutkittavat hydrogeelit olivat fibriini (ihmisperäinen), kollageeni I (rotan häntä), VitroCol® (ihmisen kollageeni I), TeloCol® (nautaeläimen telokollageeni I), gelatiini-gellaanikumi (sian iho, bakteeri) ja VitroGel® (eläinvapaa). Kuoppalevykokeissa staattisessa ympäristössä ihmisen keuhkojen fibroblasteja (WI-38) viljeltiin hydrogeeleissä kymmenen päivän ajan. Näytteiden koon muutosta mitattiin päivittäin soluviljelyn aikana. Hydrogeelien pinta-ala mitattiin koko kuopasta otettujen kuvien avulla, korkeus mitattiin mikroskoopin ja fluoresoivien partikkelien avulla, ja näiden mittaustulosten avulla näytteiden tilavuus laskettiin. Solujen elinkykyä ja morfologiaa tutkittiin viabiliteettivärjäyksen (eng. Live/Dead staining) ja sytokemiallisen värjäyksen avulla. Kudossirukokeissa ihmisen luuytimen kantasoluja ja vihreällä fluoresoivalla proteiinilla leimattuja ihmisen napanuoran endoteelisoluja viljeltiin hydrogeeleissä kudossirulla kymmenen päivän ajan. Solujen uudelleen organisoitumista, verisuonten muodostusta ja morfologiaa tutkittiin vihreän fluoresoivan proteiinin signaalin ja immunosytokemiallisten värjäyksien avulla. Kuoppalevyllä hydrogeelien ominaisuudet vaihtelivat niin koon muutoksien kuin solujen levittäytymisen suhteen. Inhibiittorit estivät testattujen hydrogeelien koon pienenemistä soluviljelyn aikana. Kudossirukokeissa suurimmassa osassa hydrogeelejä inhibiittorit eivät haitanneet verisuoniston muodostumista. Fibriinihydrogeeliin muodostunut verisuonitus oli kypsempää verrattuna verisuonitukseen muissa testatuissa hydrogeeleissä. Yhteenvetona voidaan todeta, että tässä diplomityössä hydrogeelin koon muutoksen tutkimiseen kehitettiin uusi menetelmä, hydrogeelien hajoamista tai koon pienenemistä voitiin estää inhibiittoreiden avulla ja fibriini osoittautui kaikista lupaavimmaksi hydrogeeliksi tukemaan 3D-verisuonten muodostusta ja niiden säilymistä kudossirulla.