Biofunctionalised surfaces for molecular sensing

Abstract

In many application fields, like in biosensors, the sensing biomolecules are immobilized on solid surfaces to enable measuring of very small concentrations of molecules to be analysed. Such application fields are, for example, diagnostics, detection of abused drugs, environmental monitoring of toxins and tissue engineering.<br/><br/>This thesis studies the immobilization of biomolecules (antibodies and Fab’-fragments, avidins and oligonucleotide sequences) on gold surfaces in biosensors. In order to achieve high nanomolar sensitivity even in difficult sample matrices, the effect of the sensing molecule immobilization type and concentration within these biomolecular surfaces were studied in detail. The suitability of these surfaces for neuronal stem cell attachment was also one of the topics. Real-time label-free detection was performed with surface plasmon resonance (SPR). The molecular surfaces in this study were constructed of biomolecules and repellent molecules, which formed self-assembled monolayers on gold. The molecules were immobilized on surfaces via reactive thiol- or disulphide groups. On surfaces assembled of proteins, the non-specific binding was minimized by hydrophilic polymer molecules and on surfaces assembled of oligonucleotides by means of lipoate molecules embedded on the surface in between the biomolecules, respectively.<br/><br/>With these highly sensitive biomolecular surfaces, a nanomolar detection of small sized molecules such as the 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA) drug was achieved. MDMA was analysed from a difficult sample matrix of diluted saliva. Improved orientation of surface immobilized Fab’-fragments leading to a higher sensitivity was shown with surfaces constructed of cys-tagged avidins: Fab’-fragments immobilized via thiol-biotinylation to a surface constructed of cystagged avidins bound almost ten times the amount of antigen when compared to a conventional surface constructed of non-oriented wild-type avidins. Polymer molecules embedded in between the biomolecules efficiently reduced non-specific binding. Selective neuronal cell attachment was also shown with polymer and neuronal-specific antibody molecules physisorbed on cell culture plates. Only the differentiated neuronal cells attached to surfaces physisorbed with neuronalspecific antibodies, while the non-differentiated neurospheres did not.<br/><br/>Selective surfaces were also developed for oligonucleotide sequences. Lipoatebased molecules efficiently reduced the non-specific binding of proteins and noncomplementary DNA. A nanomolar detection range was achieved for singlestranded, breast cancer-specific polymerase chain reaction (PCR) products. First, the shorter single-stranded PCR-products were analysed and a nanomolar detection range was achieved in buffer. In the following study, the DNA-surfaces were analysed in the presence of diluted serum. Even in diluted serum matrix, nanomolar concentrations of longer single- stranded sequences could be analysed due to the efficient blocking of non-specific binding of serum proteins.<br/><br/>It was found that sensitive detection surfaces for biomolecular recognition can be achieved, when optimal function of the biomolecules is ensured by immobilizing the molecules on surfaces in an oriented manner towards the analyte. Efficient reduction of non-specific binding is also important in reaching highly sensitive label-free detection. The surfaces were also found to be effective in selective neuronal stem cell attachment.

Monilla sovellusalueilla, kuten bioantureissa, tietylle analyytille herkät biomolekyylit kiinnitetään kiinteälle pinnalle, mikä mahdollistaa hyvin pienten analyyttipitoisuuksien määrittämisen. Tällaisia sovellusalueita ovat esimerkiksi sairauksien merkkiaineiden määritys, huumausaineiden tai ympäristömyrkkyjen määritys ja kudosteknologia.Tämä väitöskirja käsittelee biomolekyylien (vasta-aineiden ja Fab´-fragmenttien, avidiinien ja deoksiribonukleiinihappo (DNA) -koettimien) kiinnittämistä kultapinnoille bioantureissa. Tunnistavien molekyylien kiinnittämistapaa ja pitoisuutta biomolekulaarisilla pinnoilla tutkittiin yksityiskohtaisesti nanomolaarisen herkkyyden saavuttamiseksi myös vaikeista lähtömateriaaleista. Lisäksi tutkittiin, miten nämä pinnat soveltuvat kantasoluista erilaistettujen hermosolujen tartuttamiseen. Reaaliaikainen määritys ilman leima-aineita tehtiin pintaplasmoniresonanssin (SPR) avulla. Tutkimuksessa käytetyt itseasettuvat kalvot muodostettiin biomolekyyleistä ja hylkivistä molekyyleistä kultapinnoille. Molekyylit kiinnitettiin pinnoille tioli- tai disulfidiryhmien kautta. Proteiinipinnoilla epäspesifistä sitoutumista vähennettiin hydrofiilisten polymeerien avulla ja DNA-koetinpinnoilla vastaavasti lipoaattipohjaisten molekyylien avulla, jotka oli asetettu pinnoilla biomolekyylien väliin.Biomolekulaaristen pintarakenteiden avulla pystyttiin mittaamaan myös pienikokoinen 3,4-dimetyleenidioksimetyyliamfetamiini (MDMA) -huumausaine nanomolaarisessa pitoisuudessa. MDMA pystyttiin määrittämään myös laimennetusta sylkinäytteestä. Kysteiinimuokattujen avidiinipintojen avulla pystyttiin parantamaan Fab´-fragmenttien orientaatiota pinnoilla, mikä johti tavoiteltuihin, korkeampiin antigeenivasteisiin. Tioli-ryhmiin biotinyloituja Fab´-fragmentteja pystyttiin kiinnittämään kysteiinimuokattuihin avidiinipintoihin kymmenkertainen määrä verrattuna villityypin ei-orientoituihin avidiinipintoihin. Biomolekyylien väliin pinnoille kiinnitetyt polymeerimolekyylit ehkäisivät tehokkaasti epäspesifistä sitoutumista. Kun hermosolujen kasvatuslevyille kiinnitettiin polymeeriä ja hermosoluille spesifisiä vastaainemolekyylejä, levyille saatiin tarttumaan valikoidusti vain kantasoluista erilaistuneita hermosoluja. Kantasoluista erilaistumattomat solut eivät kiinnittyneet vastaainepolymeeripinnoille.Valikoivia pintoja kehitettiin myös DNA-koettimille. Proteiinien ja ei-pariutuvan DNA:n epäspesifinen sitoutuminen DNA-koetinpinnoille pystyttiin ehkäisemään tehokkaasti lipoaattipohjaisten molekyylien avulla. Yksijuosteiset rintasyöpäspesifiset DNA-juosteet pystyttiin tunnistamaan nanomolaarisella herkkyydellä. Ensin tutkittiin lyhyiden yksijuosteisten DNA-näytteiden tunnistusta puskuriliuoksessa saavuttaen nanomolaarinen herkkyys. Seuraavaksi DNA-pintojen toiminnallisuutta tutkittiin seerumiin laimennetuilla näytteillä. Myös pidempiä yksijuosteisia DNA-näytteitä pystyttiin määrittämään nanomolaarisina pitoisuuksina seerumilaimennoksesta, koska lipoaattipohjaiset molekyylit estivät tehokkaasti seerumin proteiinien epäspesifisen sitoutumisen pinnoille.Biomolekyylien määritykseen pystytään tekemään herkästi tunnistavia pintoja, kunhan biomolekyylien optimaalinen toiminta varmistetaan kiinnittämällä biomolekyylit pinnoille siten, että analyytin tunnistavat osat ovat orientoituneet analyyttiä kohden. Myös epäspesifisen sitoutumisen estäminen pinnoille on tärkeää korkean herkkyyden saavuttamiseksi leimavapaissa mittauksissa. Vasta-aine-polymeeripinnat todettiin hyvin toiminnallisiksi myös haluttaessa tartuttaa pinnoille valikoiden vain hermosoluja.