Ihmisen SH-SY5Y-neuroblastoomasolulinjan käyttöönotto ja erilaistaminen sähköfysiologisia monielektrodimittauksia varten
TEPPOLA, HEIDI (2008)
TEPPOLA, HEIDI
2008
Biokemia - Biochemistry
Lääketieteellinen tiedekunta - Faculty of Medicine
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2008-05-12
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-18173
https://urn.fi/urn:nbn:fi:uta-1-18173
Tiivistelmä
Tausta ja tavoitteet:
Monielektrodimittausmenetelmä (microelectrode array, MEA) mahdollistaa sähköfysiologiaan perustuvan tavan rekisteröidä biosähköisiä aktiivisuuksia verkkomaisesti viljellyistä solupopulaatioista. Tutkimuksen tavoitteena oli erilaistaa ihmisen SH-SY5Y-neuroblastoomasoluja hermosolujen kaltaisiksi, sähköisesti aktiivisiksi soluiksi sekä optimoida solujen kiinnittymistä MEA-alustaan elektrodien päälle. Eri käsittelyjen vaikutuksia solujen erilaistumiseen arvioitiin värjäämällä synaptisia vesikkeleitä ja synaptofysiiniä sekä määrittämällä keskushermoston soluille ominaisen entsyymin, ADAM23-geenin ilmentymistä erilaistuneissa soluissa.
Menetelmät: Solut käsiteltiin joko retinoiinihapolla (RA), kolesterolilla (CHOL) tai retinoiinihapolla kolesterolin kanssa (RA+CHOL). Kontrollisolujen annettiin erilaistua spontaanisti. Kymmenen päivää käsiteltyjen solujen synaptisten vesikkelien ja synaptofysiinin muodostusta seurattiin AM1-43- sekä SypI-fluoresenssivärjäyksillä. MEA-alustojen eri pinnoitevaihtoehtojen vaikutuksista solujen kiinnittymiseen ja proliferoitumiseen tehdyn selvityksen perusteella valittiin testattavat pinnoitteet, joita olivat poly-L-lysiini (PLL), poly-D-lysiini (PDL) ja polyetyleeni-imiini (PEI) laminiinin kanssa sekä laminiini yksin. Solujen kasvua pinnoitteilla tarkkailtiin mikroskopiaa hyväksikäyttäen ja saadut tuloskuvat analysoitiin tähän tarkoitukseen suunnitelluilla kuvankäsittelyalgoritmeilla. ADAM23-geenin ilmentymistä tutkittiin käsitellyissä soluissa polymeraasiketjureaktiomenetelmällä (RT-PCR).
Tulokset: RA- ja RA+CHOL-käsittelyt saivat aikaan pitkiä neuriitteja ja niiden lisääntynyttä haaroittuneisuutta. Lisäksi RA, CHOL ja RA+CHOL indusoivat ekso- ja endosytoivaa vesikkelikierrätystä ja synaptofysiinin ilmentymistä. Solut kiinnittyivät MEA-alustaan, joka oli pinnoitettu PLL/PDL/PEI+laminiilla tai pelkällä laminiinilla sekä pinnoittamattomaan alustaan. Automaattinen kuvankäsittelyohjelma vahvisti, että pinnoitettaessa PEI+laminiini-pinnoitteella solutiheys oli alhaisin, mutta solujen morfologia, kypsyys ja jakaantuminen oli eniten hermosolujen kaltaista. ADAM23-geenin ilmentyminen oli heikentynyt CHOL-käsitellyissä soluissa.
Johtopäätökset: RA+CHOL-käsittely havaittiin parhaaksi vaihtoehdoksi erilaistaa SH-SY5Y-soluja hermosolujen kaltaisiksi soluiksi. PEI+laminiini käyttäytyi pinnoitteena eri tavalla kuin PLL/PDL+laminiini tai pelkkä laminiini. PEI+laminiini on lupaava pinnoiteyhdiste MEA-tutkimuksiin, koska soluja kiinnittyy vähemmän ja ne ovat morfologialtaan hermosolujen kaltaisia. PDL/PLL+laminiini sekä laminiini ovat hyviä pinnoitevaihtoehtoja, kun soluja halutaan kiinnittyvän paljon MEA-alustalle. ADAM23-geenin ilmentymisen heikkeneminen CHOL-käsitellyissä soluissa vaatii jatkotutkimuksia.
Monielektrodimittausmenetelmä (microelectrode array, MEA) mahdollistaa sähköfysiologiaan perustuvan tavan rekisteröidä biosähköisiä aktiivisuuksia verkkomaisesti viljellyistä solupopulaatioista. Tutkimuksen tavoitteena oli erilaistaa ihmisen SH-SY5Y-neuroblastoomasoluja hermosolujen kaltaisiksi, sähköisesti aktiivisiksi soluiksi sekä optimoida solujen kiinnittymistä MEA-alustaan elektrodien päälle. Eri käsittelyjen vaikutuksia solujen erilaistumiseen arvioitiin värjäämällä synaptisia vesikkeleitä ja synaptofysiiniä sekä määrittämällä keskushermoston soluille ominaisen entsyymin, ADAM23-geenin ilmentymistä erilaistuneissa soluissa.
Menetelmät: Solut käsiteltiin joko retinoiinihapolla (RA), kolesterolilla (CHOL) tai retinoiinihapolla kolesterolin kanssa (RA+CHOL). Kontrollisolujen annettiin erilaistua spontaanisti. Kymmenen päivää käsiteltyjen solujen synaptisten vesikkelien ja synaptofysiinin muodostusta seurattiin AM1-43- sekä SypI-fluoresenssivärjäyksillä. MEA-alustojen eri pinnoitevaihtoehtojen vaikutuksista solujen kiinnittymiseen ja proliferoitumiseen tehdyn selvityksen perusteella valittiin testattavat pinnoitteet, joita olivat poly-L-lysiini (PLL), poly-D-lysiini (PDL) ja polyetyleeni-imiini (PEI) laminiinin kanssa sekä laminiini yksin. Solujen kasvua pinnoitteilla tarkkailtiin mikroskopiaa hyväksikäyttäen ja saadut tuloskuvat analysoitiin tähän tarkoitukseen suunnitelluilla kuvankäsittelyalgoritmeilla. ADAM23-geenin ilmentymistä tutkittiin käsitellyissä soluissa polymeraasiketjureaktiomenetelmällä (RT-PCR).
Tulokset: RA- ja RA+CHOL-käsittelyt saivat aikaan pitkiä neuriitteja ja niiden lisääntynyttä haaroittuneisuutta. Lisäksi RA, CHOL ja RA+CHOL indusoivat ekso- ja endosytoivaa vesikkelikierrätystä ja synaptofysiinin ilmentymistä. Solut kiinnittyivät MEA-alustaan, joka oli pinnoitettu PLL/PDL/PEI+laminiilla tai pelkällä laminiinilla sekä pinnoittamattomaan alustaan. Automaattinen kuvankäsittelyohjelma vahvisti, että pinnoitettaessa PEI+laminiini-pinnoitteella solutiheys oli alhaisin, mutta solujen morfologia, kypsyys ja jakaantuminen oli eniten hermosolujen kaltaista. ADAM23-geenin ilmentyminen oli heikentynyt CHOL-käsitellyissä soluissa.
Johtopäätökset: RA+CHOL-käsittely havaittiin parhaaksi vaihtoehdoksi erilaistaa SH-SY5Y-soluja hermosolujen kaltaisiksi soluiksi. PEI+laminiini käyttäytyi pinnoitteena eri tavalla kuin PLL/PDL+laminiini tai pelkkä laminiini. PEI+laminiini on lupaava pinnoiteyhdiste MEA-tutkimuksiin, koska soluja kiinnittyy vähemmän ja ne ovat morfologialtaan hermosolujen kaltaisia. PDL/PLL+laminiini sekä laminiini ovat hyviä pinnoitevaihtoehtoja, kun soluja halutaan kiinnittyvän paljon MEA-alustalle. ADAM23-geenin ilmentymisen heikkeneminen CHOL-käsitellyissä soluissa vaatii jatkotutkimuksia.